大鼠腸粘膜組織鮮味受體傳感動力學研究

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(1.上海海洋大學食品學院,上海 201406; 2.天津商業大學食品科學與生物技術學院,天津 300134; 3.上海交通大學農業與生物學院,上海 200240)

我國關于鮮味的最早記錄是宋朝林洪在《山家清供》中記載竹筍“其味甚鮮”,現代是由池田菊苗于1908年發現,并第一次提出了鮮味的概念[1],用來描述海藻提取物-谷氨酸鈉的味道。食品中的鮮味物質包括氨基酸類、核苷酸類、小肽類、其他有機酸類和有機堿類。鮮味由味覺感受細胞上多種不同的鮮味受體傳感,主要包括mGluR4和mGluR1兩種親谷氨酸代謝受體與味覺受體異源二聚體T1R1/T1R3[2]。兩種代謝型鮮味受體主要發生在后舌,有助于其他口味的鮮味和化合物之間的辨別行為,異源二聚體T1R1/T1R3主要在舌前部的菌狀乳突和軟腭中共表達。味覺受體主要分布于味蕾組織上,將味覺信號傳遞到大腦從而感受到味道,達到控制飲食的目的。已有研究表明,鮮味受體不僅分布在味蕾中,還分布在身體的各個細胞、組織和器官中,特別是腸道系統中[3],表明鮮味受體具有其他功能。越來越多的證據表明味覺受體在人體內消化和代謝調控過程中發揮重要的調控作用[4-5]。鮮味受體在腸黏膜內分泌細胞中表達,與其他化學信號分子相協調,調節能量和葡萄糖穩態[6-7]。大量研究表明,分布在腸道系統中的味覺受體通過調節機體代謝與內分泌系統,吸收營養,合成自身成分(如氨基酸),或通過交感-副交感神經系統作用于下丘腦、腦垂體,調節機體的神經內分泌系統[8-9]。

本實驗室前期對大鼠腸道組織的磷酸化蛋白組學研究表明,機體通過腸道控制代謝的基因主要在空腸的第二段表達。所以本研究就選用谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉和鳥苷酸二鈉這三種典型的鮮味物質。選取空腸第二段黏膜組織為材料,制備電化學型組織傳感器,探討這3種鮮味物質在空腸中與其相應受體作用的動力學特性和參數,推測鮮味受體與這些鮮味物質的傳感、吸收、運轉調節中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Sprague Dawley(SD)大鼠 體重200 g左右,雄性，8～10周齡，天津市翔天科技有限公司；可溶性淀粉 天津市贏達稀貴化學試劑廠;海藻酸鈉 天津市光復精細化工研究所;戊二醛 天津博迪化工股份有限公司;核微孔膜 英國Whatman公司;CaCl2、CollagenaseⅡ、DispaseⅡ、谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉 美國Sigma公司;所有試劑 均為分析純;水為超純水。

LCQ分析天平 上海精密科學儀器有限公司;Millipore Milli-Q純水 上海雅榮生化設備儀器有限公司;KQ 3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;LRH-70生化培養箱 上海一恒科技有限公司;CHI600E電化學工作站、三電極系統(玻碳電極(GCEΦ=3 mm)、參比電極-Ag/AgCl電極、對電極-鉑絲電極) 上海辰華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計方法 受體與配體相互結合,符合酶與底物相互作用的動力學曲線,即受體配體相互結合,隨著配體濃度的增大,通過電化學工作站而計算出的電流變化率為,先不斷增長,再趨于穩定,即在受體未飽和的情況下,不斷與配體相結合,當飽和后,電流不再發生變化。

1.2.2 腸粘膜組織的制備 大鼠脫頸致死,用手術刀剖開腹部,取大鼠空腸組織第二段(從近十二指腸的空腸組織開始,以10 cm為一個段,取第二段),再用剪刀剪為三段,洗凈內容物,用刀片將腸段剖開為平面,取0.25 cm2的腸粘膜平面置于生理鹽水中待用。

1.2.3 腸粘膜組織鮮味傳感器的制備 將1 g可溶性淀粉溶解于100 mL 1%的戊二醛水溶液中,80 ℃水浴加熱并攪拌30 min,配成一定質量濃度的淀粉溶液,室溫下放置過夜,使淀粉與戊二醛得到充分的交聯,獲到醛基化淀粉膠溶液。將2 g海藻酸鈉加入100 mL超純水中制成溶液,再與醛基化淀粉膠溶液1∶1混合[10-12]。取上述溶液10 μL,均勻涂抹于2張直徑為25 mm、孔徑為0.22 μm聚碳酸酯微孔膜上,將準備好的0.25 cm2腸粘膜組織放置于一張微孔膜的圓心上,然后將另一張聚碳酸酯微膜覆蓋其上,制成三明治結構的測定膜。將制成的腸粘膜組織膜浸入5 g/100 mL的CaCl2溶液中10 s后取出,使海藻酸鈉與CaCl2發生離子交換反應形成穩定的螯合物,凝膠化成良好的固定劑[13-14]。然后用生理鹽水沖洗腸粘膜組織膜(去除膜上存留的Cl-、Ca2+等)。最后,將腸粘膜組織膜固定在玻碳電極頭的表面,使得腸粘膜組織與表征完全的電極芯重合,制成鮮味生物傳感器。

1.2.4 鮮味生物傳感器對鮮味物質的測定方法 采用三電極系統,將固定好腸粘膜組織測定膜的玻碳電極作為工作電極,Ag/AgCl電極作為參比電極,鉑絲電極作為對電極,以超純水為空白對照,-0.38 V,通過電流-時間測定法測定不同濃度(10-14～10-1mol/L)的谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉的響應電流,以響應電流的變化率作為檢測指標[15],響應電流的變化率的計算公式為:

式(1)

式中:I1及I2分別表示鮮味物質被測定前后同一時間點的穩態電流值(A)。

1.3 數據處理

利用chi660電化學工作站測定指定濃度范圍內的穩定電流值,再用excel表計算出如式1中的電流變化率,將這些值放入Orgin9軟件中,利用線性擬合曲線和非線形擬合曲線分別作圖。

2 結果與分析

2.1 電流-時間測定法的電位優化

制備好的傳感器在不同電位下(測試底液為超純水)用電流-時間法進行測定,以加入10-5mol/L的谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉前后穩態電流差,來衡量不同電位對傳感器電化學響應效果的影響,以電位的負值(-E)為橫坐標、電流前后變化率為縱坐標作圖。結果表明,在-0.38 V條件下電流的變化值最大,說明在此電流值下,鮮味物質的響應最明顯。故選定-0.38 V為恒電位進行鮮味生物傳感器對谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉響應特性的研究。

2.2 鮮味配體與鮮味受體檢測范圍作用曲線

將固定化腸粘膜組織的電化學傳感器置于不同濃度的谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉從低濃度(10-14mol/L)到高濃度(10-1mol/L)作時間-電流法掃描,掃描電位選擇-0.38 V,使受體和配體充分結合后,選擇第90秒電流值作為穩態電流,以電流在受體-配體結合前后的變化率ΔI與配體的濃度作圖。為便于作圖,以谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉濃度的對數值為橫坐標,響應電流的變化率為縱坐標作圖,如圖1。

圖1 谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉在檢測范圍內的電流變化率Fig.1 Current change rates of sodium glutamate,disodium inosinate,disodium guanylate in the detection range

由圖1可以看出:谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉電流變化率達到穩定時的響應范圍基本相同(基本都是在10-11mol/L達到穩定),與動力學曲線與酶促反應相似[16-18]。即在低配體濃度時,其信號輸出與配體濃度成正比;當配體濃度達到一定值時,信號輸出達到最大值;隨配體濃度的增加,信號輸出不再增加(如圖2)。由此,可以參照酶的動力學特性和參數對鮮味配體與其受體作用所產生的信號輸出進行動力學分析。

2.3 鮮味配體與受體作用引發的信號輸出動力學曲線

如圖1可看出谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉都在10-14～10-11mol/L的濃度范圍內,與響應電流的變化率呈現良好的遞增關系。由此,在此范圍內,將三種鮮味物質在10-14～10-11mol/L濃度進一步細分,以檢測的鮮味配體(谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉)的濃度為橫坐標、電流的變化率為縱坐標作圖,根據酶-底物結合動力學公式[16]:

[L]+[R]?[LR]?信號放大(輸出)

式(2)

[L]代表配體,[R]代表受體,上式表述為配體受體相互結合,產生信號,放大輸出。進行雙曲線擬合所得曲線如圖2。

根據Orgin9自帶的生成方程式方法可知,其擬合方程見表1:

表1 鮮味配體與受體作用雙曲線方程Table 1 Hyperbolic equation of the umami ligand and the receptor

由圖2可知,鮮味物質(谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉)與其受體的作用曲線符合雙曲線,具有配體-受體飽和效應,與酶-底物作用動力學相似[16]。根據表1方程,分別以谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉濃度的倒數為橫坐標、以電流變化率的倒數為縱坐標作圖(即雙倒數法作圖)[17],得圖3。

圖3 谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉在10-14～10-11 mol/L濃度范圍內與電流變化率的雙倒數法回歸曲線Fig.3 Double reciprocal regression curve of sodium glutamate,disodium inosinate,disodium guanylate in the concentration range of 10-14 mol/L to 10-11 mol/L

圖2 谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉濃度對電流變化率的雙曲線擬合圖Fig.2 Hyperbolic fitting of sodium glutamate,disodium inosinate and disodium guanylate on current rate of change

上述函數所擬合的線性回歸方程見表2:

表2 鮮味配體與受體作用線性回歸方程Table 2 Linear regression equation of the umami ligand and the receptor

由上可知R2都大于0.95,此擬合效果良好,此雙倒數法可靠。

2.4 鮮味受體與鮮味配體激活常數

根據研究結果我們根以及米氏方程[18]可計算得到:谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉與其受體相互作用的激活常數分別為:Ka=1.136×10-13mol/L,Kb=1.443×10-13mol/L,Kc=2.080×10-13mol/L。

即對大鼠空腸第二段而言,在這3種物質之間,谷氨酸鈉的活性最高、肌苷酸二鈉第二、鳥苷酸二鈉最低。K越小,說明配體通過與受體作用產生的細胞信號輸出的效率越高。當所有細胞輸出信號都達到最大時,細胞上的受體(或結構域)全部被飽和,因此該激活常數實質上反映了平均每個細胞上能夠與配體結合的受體(或結構域)數量,K越小,說明平均每個細胞上受體(或結構域)數量越少。由此再計算平均每個腸粘膜細胞上鮮味受體的數目。

2.5 平均每個腸粘膜細胞上鮮味受體的數目

由2.4可計算受體數目,計算方法如下,如:當平均每個細胞上只有1個受體時,每個細胞就只有兩種狀態:無信號放大作用的“0”和最大信號輸出“1”。

根據已有研究方法[19],定義每個細胞上的受體數量如下:

式(3)

其中:CM是細胞上受體個數不為1時,到達最大響應信號的濃度;CL是細胞上只有1個受體時達到最大響應信號的濃度(此研究中,CL的值為10-14mol/L)。

根據上述公式,結合2.4計算出的活性常數,分別可得平均每個腸粘膜組織細胞上谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉的受體數量分別為:2.30、2.89、4.16/cell。可以看出平均每個腸粘膜細胞上鳥苷酸二鈉的受體數量最多,其次為肌苷酸二鈉,最低為谷氨酸鈉。

2.6 對細胞信號級聯放大倍數的估算

為了能夠更準確估算配體與受體相互所產生的細胞信號放大作用,需要用裸電極在不同濃度(10-14～10-11mol/L)的配體溶液中所產生的電流響應值作為對照,以排除裸電極的影響。以檢測溶液濃度的對數值為橫坐標,以電流變化率為縱坐標,用oringin9作圖,并用直線擬合。谷氨酸鈉、肌苷酸二鈉、鳥苷酸二鈉這三種鮮味配體與裸電極的作用方程見表3:

表3 鮮味物質與裸電極作用方程Table 3 The equation of the umami substance and bare electrode

由式3得當濃度為K時所對應的電流變化率。分別帶入表3的裸電極方程式可算出對應裸電極的濃度,由此計算信號放大倍數,結果見表4。

表4 鮮味物質信號放大倍數Table 4 The umami substance signal amplification

由圖4可知,由信號放大倍數可以看出:N1>N2>N3,即谷氨酸鈉放大倍數最大,其次為肌苷酸二鈉,最低為鳥苷酸二鈉。此結果和上文所得到的活性常數和平均每個細胞上的受體數目相對應,說明配體與受體作用產生的信號輸出的效率越高,則信號放大倍數也越大,且此生物傳感器能在極低濃度的(10-14～10-11mol/L)配體溶液下,極大地放大信號倍數,檢測閾值低,為在低濃度的配體溶液中識別并檢測鮮味物質打下堅實的基礎,這也從側面猜測:受體-配體互作所產生的生物活性主要取決于它們所引起胞內信號的級聯放大作用,不同的配體所激活的和放大途徑不同。

圖4 工作電極(添加腸粘膜電極)與裸電極比較圖Fig.4 Working electrode(adding intestinal mucosa electrode) comparison of bare electrodes

3 結論

結果表明:激活常數K值鳥苷酸二鈉最大,其次為肌苷酸二鈉和谷氨酸鈉。信號輸出效率為谷氨酸鈉最高,肌苷酸二鈉第二,鳥苷酸二鈉最低。當輸出效率越高時,平均每個腸粘膜細胞上的效應受體數目及信號放大倍數也越高。說明腸道對這四種鮮味物質的傳感,實際上是通過激活細胞信號放大與傳遞來進行的。

機體對鮮味物質的傳感不僅通過味覺系統進行食欲控制,更重要的是通過腸黏膜等復雜的受體系統進行傳感、吸收、運轉、儲藏、代謝與控制。本項研究結果表明:可以通過固定化腸黏膜組織所制備的生物傳感器進行動力學測定,通過激活常數,平均每個腸粘膜細胞上的受體個數,對細胞信號級聯放大倍數的估算,進一步揭示食品中的不同功能性成分如何通過腸黏膜受體發揮營養和代謝控制作用。該方法在食品營養、功能評價和藥物篩選等方面具有廣闊的應用前景。