哈密瓜(Cucumis melo L.)致腐真菌的鑒定

,,,, ,,

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心,北京100097; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),遼寧沈陽110866; 3.喀什大學(xué),新疆喀什 844006; 4.果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100097;5.農(nóng)業(yè)部蔬菜產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100097)

哈密瓜(CucumismeloL.)主產(chǎn)于新疆,自2015年以來,種植面積穩(wěn)定在120萬畝左右,總產(chǎn)量為280萬噸左右,其中大約70%銷往內(nèi)地[1]。在銷售過程中,大部分哈密瓜采用常溫平板車運(yùn)輸方式,缺乏預(yù)冷、冷鏈運(yùn)輸系統(tǒng),約有15%的果實(shí)發(fā)生腐爛[2]。引起果實(shí)腐爛主要有兩個(gè)原因,一個(gè)是哈密瓜在常溫運(yùn)輸過程中,生理代謝加速,從而發(fā)熱引起腐爛[3];另一種是真菌侵害引起的腐爛。目前,生理代謝加速引起的腐爛可以通過果實(shí)預(yù)冷或冷藏車儲(chǔ)運(yùn)的方式減少;真菌引起的腐爛可以通過消毒劑處理的方式減少[4]。但是,引起哈密瓜腐爛真菌的種類還存在一定爭(zhēng)議,部分研究者認(rèn)為青霉屬、毛霉屬、曲霉屬和根霉屬真菌是引起哈密瓜腐敗的主要病原菌[5-7],而其他研究者認(rèn)為鏈格孢屬、鐮孢屬和根霉屬是主要致腐菌[8-10]。而且,上述學(xué)者對(duì)哈密瓜上致腐真菌的鑒定主要是通過顯微鏡觀察菌落特征來鑒定的,缺少進(jìn)一步的科學(xué)證據(jù)。因而,引起哈密瓜腐敗的真菌種類有待于進(jìn)一步鑒定。

鑒定真菌種類的方法除了使用顯微鏡觀察菌落特征外,還可以從微生物表型特征和分子學(xué)方面對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。微生物表型芯片系統(tǒng)(PMs)是利用微生物對(duì)95種不同碳源的代謝情況,確定微生物的表型,從而將微生物鑒定至種、亞種水平上[11-13]。分子生物學(xué)方面,采用ITS(Internal transcribed spacer)基因序列可以獲得菌株的遺傳信息,從而確定真菌種類,并為其系統(tǒng)發(fā)育的研究提供重要依據(jù)[14-15]。

因此,本課題組從哈密瓜表面分離出兩種具有致腐作用的真菌,結(jié)合顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察、表型特征和分子學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定,以期明確引起哈密瓜腐爛的主要菌種,為減少哈密瓜采后腐敗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

哈密瓜和土豆 北京市果香四溢蔬菜超市(曙光花園店);葡萄糖(分析純) 北京化工廠;瓊脂 北京輝宏德業(yè)生物科技有限公司;FF-IF接種液(FF板) 美國Biolog公司;TaKaRa Fungi Identification PCR Kit(Code No.RR178)、TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164) 寶生物工程(大連)有限公司。

Incucell系列恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國MMM集團(tuán);G154DW型高壓滅菌鍋 美國致微公司;DL-CJ-2N雙人雙面超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;Gen III Microstation 美國Biolog公司;TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600 PCR擴(kuò)增儀 TaKaRa BIO INC.;Mupid核酸電泳儀 ADVANCE-BIO Co.,Ltd;EPS300 蛋白質(zhì)電泳儀 上海天能;ImageMaster?VDS電泳成像裝置 Pharmacia Biotech公司;ABI PRISMTM3730XL DNA測(cè)序儀 美國Applied Biosystem公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物純化及其形態(tài)觀察 PDA培養(yǎng)基:稱取馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂18 g,加水補(bǔ)足1 L,121 ℃滅菌15 min。將哈密瓜置于25～30 ℃環(huán)境中,待哈密瓜表面出現(xiàn)由微生物引起的軟化腐爛現(xiàn)象時(shí),將微生物利用無菌接種環(huán)在PDA培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)7 d,然后將不同菌落的微生物挑出劃線培養(yǎng)至新的PDA培養(yǎng)基上,直至純化為單一菌落。將單一菌落的微生物置于PDA培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)7 d,用顯微鏡觀察菌落形態(tài)和顏色,物鏡40倍,目鏡10倍,拍照。

1.2.2 表型特征分析 將分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d,用一次性無菌接種棉簽將真菌孢子接種至FF-IF接種液中,使用濁度計(jì)調(diào)整菌懸液的菌體濃度至濁度為75%±2%,將配好的菌懸液用移液槍接種至FF板上,每孔100 μL。置于25 ℃培養(yǎng),在24、48、72和96 h分別用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)在490和750 nm下記錄吸光值,獲得致腐菌對(duì)95種碳源的消耗情況以及生長情況。

1.2.3 ITS基因測(cè)序、比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 在培養(yǎng)基中挑取菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件:80 ℃,15 min。使用TaKaRa Fungi Identification PCR Kit(Code No.RR178)試劑盒對(duì)分離的菌株ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR 反應(yīng)體系中含上述變性反應(yīng)液1 μL;PCR premix 25 μL;引物(20 pmol/L)各0.5 μL;無菌超純水補(bǔ)足總體積至50 μL。ITS區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸l min,30個(gè)循環(huán),72 ℃ 延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 產(chǎn)物加1 μL 6倍溴酚藍(lán)上樣緩沖液,在3%瓊脂糖凝膠上200 mA 電泳15 min 進(jìn)行檢測(cè),EB染色后于紫外燈下觀察電泳條帶,切膠回收目的片段進(jìn)行測(cè)序,使用ABI PRISMTM 3730XL DNA Sequencer測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索,比較純化菌株與已知霉菌相應(yīng)序列的同源性。為進(jìn)一步顯示實(shí)驗(yàn)菌株與已知菌株的親緣關(guān)系及其分類地位,根據(jù)同源序列搜索結(jié)果與表型鑒定分析得到的幾種相似度最高的菌種進(jìn)行對(duì)比,提取相關(guān)模式菌株的ITS區(qū)基因序列,用MEGA7.0軟件選用參數(shù)P-距離和成對(duì)刪除法,將序列資料轉(zhuǎn)換成距離后以鄰位歸并法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并通過Bootstraps進(jìn)行1000次漸啟式復(fù)制以檢驗(yàn)進(jìn)化樹枝的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)及顯微鏡觀察

由圖1可知,菌株A在培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量氣菌絲,氣生菌絲為白色棉絮狀,菌落突起呈白色。分生孢子呈紡錘形至鐮刀形,彎曲或端直,3個(gè)隔膜的多。菌株B菌絲匍匐,生長初期菌絲為白色,后變?yōu)楹诤稚?分生孢子倒棒狀呈現(xiàn)橢球形,頂端延長成喙?fàn)?顏色呈淡褐色,孢子壁光滑,內(nèi)部隔膜觀察明顯,具有3個(gè)或多個(gè)隔膜。將菌落形態(tài)與《真菌鑒定手冊(cè)》[16]進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)菌株A可能為鐮刀屬,菌株B可能為鏈格孢屬。

圖1 菌株A和菌株B的菌落特征以及顯微形態(tài)Fig.1 Colony characteristics and micromorphology profiles of strain A and strain B

2.2 微生物表型芯片系統(tǒng)(PMs)表型特征分析

PMs將95種碳源脫水干燥后填充于96孔板中,通過加入碘硝基四唑紫為指示劑來顯示微生物對(duì)不同碳源的利用情況[17-18]。將菌株A和菌株B接種于上述96孔板中,將生長過程中,菌株A和菌株B碳源利用情況和生長情況與數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。在碳源利用方面,菌株A共可以利用72種碳源,與數(shù)據(jù)庫中FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGA、FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGB和Fusariumchlamydosporum對(duì)碳源的利用相似度最高(圖2),其中菌株A的碳源消耗與FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGA的相似度為77.1%,與FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGB的相似度為76.0%,與Fusariumchlamydosporum的相似度為71.9%。菌株A與上述3種真菌均可利用碳源有杏苷、糊精、D-半乳糖、D-葡萄糖酸、麥芽糖、肝糖、L-鼠李糖、L-山梨糖、L-乳酸等58種碳源。在菌株生長情況方面,菌株A的生長情況與FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGA的相似度為81.3%,與FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGB的相似度為85.4%,與Fusariumchlamydosporum的相似度為80.2%。

圖2 菌株A與Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGA、Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGB和Fusarium chlamydosporum的對(duì)比Fig.2 Comparison of strain A with Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGA, Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGB and Fusarium chlamydosporum注:其中,A、B和C分別為菌株A與Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGA、Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGB和Fusarium chlamydosporum的碳源利用情況對(duì)比;D、E和F分別為菌株A與Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGA、Fusarium oxysporum Schlechtendahl:Fries BGB和Fusarium chlamydosporum的生長情況對(duì)比。灰色為物質(zhì)利用/生長情況相同,黑色為物質(zhì)消耗/生長情況不同。

在碳源利用方面,菌株B共可以利用54種碳源,與數(shù)據(jù)庫中Alternariaalternata[Fries]Keissl.BGA、Phomasorghina(Saccardo)Boerema和Curvularialunatavar lunata[Wakker]Boedjin BGA的碳源利用情況相似度最高(圖3),其中菌株B的碳源消耗與Alternariaalternata[Fries]Keissl.BGA的相似度為76.0%,與Phomasorghina(Saccardo)Boerema的相似度為74.0%,與Curvularialunatavar lunata[Wakker]Boedjin BGA的相似度為67.7%。菌株B與上述3種真菌均可利用碳源有L-阿拉伯糖、D-果糖、丙三醇、蔗糖和木糖醇等45種碳源。在菌株生長情況方面,菌株B的生長情況與Alternariaalternata[Fries]Keissl. BGA的相似度為83.3%,與Phomasorghina(Saccardo)Boerema的相似度為79.2%,與Curvularialunatavar lunata[Wakker]Boedjin BGA的相似度為76.0%。

圖3 菌株B與Alternaria alternata[Fries]Keissl.BGA、Phoma sorghina(Saccardo)Boerema和Curvularia lunata var lunata[Wakker]Boedjin BGA的對(duì)比Fig.3 Comparison of strain B with Alternaria alternata[Fries]Keissl.BGA, Phoma sorghina(Saccardo)Boerema and Curvularia lunata var lunata[Wakker]Boedjin BGA注:其中,A、B和C分別為菌株B與Alternaria alternata[Fries]Keissl. BGA、Phoma sorghina(Saccardo)Boerema和Curvularia lunata var lunata[Wakker]Boedjin BGA的碳源利用情況對(duì)比;D、E和F分別為菌株B與Alternaria alternata[Fries]Keissl.BGA、Phoma sorghina(Saccardo)Boerema和Curvularia lunata var lunata[Wakker]Boedjin BGA的生長情況對(duì)比。灰色為物質(zhì)利用/生長情況相同,黑色為物質(zhì)消耗/生長情況不同。

以相似度為排序指標(biāo),根據(jù)菌株A和B的PMs比對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序[19-20],菌株A與尖孢鐮刀菌的相似度最高,菌株B與鏈格孢菌的相似度最高。

2.3 ITS序列分析

圖4顯示菌株A和菌株B ITS rDNA PCR的電泳圖。正對(duì)照有條帶證明PCR擴(kuò)增試劑正常,負(fù)對(duì)照無條帶,樣品1、2有條帶,說明電泳結(jié)果正常。菌株A和菌株B的PCR條帶清晰完整,ITS區(qū)rDNA片段約為750 bp。

圖4 菌株A和B的ITS rDNA PCR的電泳圖Fig.4 Electrophoresis profile of PCR product of ITS rDNA of strain A and strain B注:M:Marker;1:菌株A;2:菌株B;+:正對(duì)照;-:負(fù)對(duì)照。

2.4 菌株A和菌株B在NCBI比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)Biolog表型鑒定得到的相似度最高的幾個(gè)菌種(FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGA、FusariumoxysporumSchlechtendahl:Fries BGB和Fusariumchlamydosporum),菌株A與鐮刀菌屬中的尖孢鐮刀菌和禾谷鐮刀菌的相似度最高,因此將分離得到的菌株A的ITS區(qū)rDNA基因部分序列與GenBank內(nèi)登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建菌株A與已知菌株的ITS區(qū)rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)(表1),結(jié)果表明菌株A與Fusariumoxysporum,Fusariumoxysporumf. sp.melonis的同源性分別達(dá)到了100%和99%,而菌株A與Fusariumchlamydosporum的同源性達(dá)到了95%。

表1 菌株A ITS rDNA序列在NCBI同源性比對(duì)結(jié)果Table 1 NCBI alignments of ITS rDNA gene sequence of strain A

由圖5的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果可以看出，菌株A與Fusariumoxysporumf. sp.melonis在同一分枝上,且通過Bootstraps的驗(yàn)證表明它們具有較高的置信度,支持率達(dá)94%。在菌株A和Fusariumoxysporumf. sp.melonis菌種的進(jìn)化枝上,進(jìn)化分支長度均為0.00,而Fusariumoxysporum的進(jìn)化分支長度為1.35。結(jié)合形態(tài)特征以及與《真菌鑒定手冊(cè)》中的尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)描述進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)果基本一致,因此可將本研究分離到的菌株A確定為尖孢鐮刀菌甜瓜轉(zhuǎn)化型。

圖5 基于菌株A ITS rDNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS rDNA sequence of strain A

根據(jù)Biolog表型鑒定得到的相似度最高的幾個(gè)菌種(Alternariaalternata,Phomasorghina和Curvularialunata),菌株B與鏈格孢菌、莖點(diǎn)霉菌和月狀彎孢菌相似度最高,因此將分離得到的菌株B的ITS區(qū)rDNA基因部分序列與GenBank內(nèi)登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建鑒定菌株與已知菌株的ITS區(qū)rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)(表2),結(jié)果表明菌株B與Alternariaalternata的同源性均達(dá)到了100%,而菌株B與Phomasorghina和Curvularialunata的同源性都只達(dá)到了89%。

表2 菌株B ITS rDNA基因序列的NCBI同源性比對(duì)Table 2 NCBI alignment of the ITS rDNA gene sequence of strain B

由圖6的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果可以看出，菌株B與AlternariaalternataLC171718.1 在同一分枝上,且通過Bootstraps的驗(yàn)證表明它們具有較高的置信度,支持率可達(dá)99%。在菌株B和Alternariaalternata菌種的進(jìn)化枝上,進(jìn)化分支長度均為0.00,而菌株B與Phomasorghina和Curvularialunata的進(jìn)化分支長度分別為3.08和2.26。因此,結(jié)合形態(tài)特征(圖1d、圖1f)以及與《真菌鑒定手冊(cè)》中的鏈格孢菌(Alternariaalternata)描述進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)結(jié)果基本一致,因此可將本研究分離到的菌株B確定為鏈格孢菌。

圖6 基于菌株B ITS rDNA 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on ITS rDNA sequence of strain B

3 結(jié)論

從哈密瓜上分離純化出兩株具有引起果實(shí)腐爛能力的菌株A和菌株B,其中菌株A可利用碳源包括杏苷、糊精、D-半乳糖、D-葡萄糖酸、麥芽糖、肝糖、L-鼠李糖、L-山梨糖、L-乳酸等72種碳源;其ITS rDNA序列與尖孢鐮刀菌甜瓜轉(zhuǎn)化型(Fusariumoxysporumf. sp.melonis)的同源性為99%,分支長度為0.00。菌株B可利用碳源包括L-阿拉伯糖、D-果糖、丙三醇、蔗糖和木糖醇等54種碳源;其ITS rDNA序列與鏈格孢菌(Alternariaalternata)的同源性為100%,分支長度為0.00。結(jié)合形態(tài)學(xué)、表型鑒定以及分子生物學(xué)鑒定推測(cè)，菌株A為尖孢鐮刀菌甜瓜轉(zhuǎn)化型,菌株B為鏈格孢菌。