醬香大曲間微生物群落結構時空特征的表征

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(1.四川大學輕紡與食品學院,四川成都 610065;2.皮革化學與工程教育部重點實驗室,四川成都 610065;3.國家固態釀造工程技術研究中心,四川瀘州 646000)

釀酒大曲既是中國傳統白酒生產過程必需的發酵劑和粗酶制劑,又是重要的釀酒原料,在白酒的釀造過程中,影響微生物群落的繁殖與代謝的同時,也與基酒獨特風味的形成密切相關[1-2]。大曲的群落及風味特征主要取決于環境溫度和濕度等參數。這些參數在制曲過程中對群落結構的定向馴化,對群落代謝調控及產物的形成具有重要的作用。醬香型大曲群落中優勢菌群組成類似其所用的高溫大曲,與所用原料中的優勢菌群結構類似。二者的優勢細菌都是芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和鏈霉菌(Streptomyces)[3-6]等,豐度最高之一的Bacillus分泌的代謝產物包括水解酶類和吡嗪類等,后者對醬香型大曲酒獨特風味形成的貢獻顯著[7-10]。疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、漢森酵母屬(Hansenula)、念珠菌(Candida)和畢赤酵母屬(Pichia)則是其優勢真菌[11],其豐度對生物活性組分(如多種水解酶等)的影響顯著[12]。王曉丹等[13]對貴州省三個醬香型大曲細菌群落結構的高通量測序結果表明,高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)的豐度最高,Bacillus和Scopulibacillus次之,與已有的報道略有不同,如Bacillus被認為豐度是最高[5-6],或未檢出Thermoactinomyces[14],可能與檢測方法與條件有關。

中國赤水河流域星羅密布醬香型白酒企業,生產方法相似,但產品風格迥異,可能是大曲群落及代謝組分的差異所致。本文敘述了基于高通量測序技術，研究生產區域、企業、場地及陳曲時間不同樣品的微生物群落組成的差異,經聚類和非度量多維測度分析(non-metric multidimensional scaling analysis,NMDS)等方法揭示其群落結構的時空性特征的結果，以期為傳承和優化醬香大曲生產工藝奠定重要方法學及實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MBQ(茅臺鎮大曲) 取自貴州省懷仁市茅臺鎮的著名醬香型白酒集股份有限公司;MEQ(習酒鎮大曲) 取自上述集團公司在貴州省習水縣習酒鎮生產基地;LEQ(二郎鎮大曲)、LGQ(黃荊壩大曲) 分別取自四川省古藺縣二郎鎮(與習酒鎮是隔赤水河相鄰)某著名醬香型白酒股份有限公司兩個不同生產基地;XTQ(仙潭鎮三月大曲)、XXQ(仙潭鎮六月大曲) 取自四川省古藺縣太平鎮(與二郎鎮僅距30km)的大型醬香型白酒企業的陳曲時間分別是3個月和6個月的樣品;Tris-HCl、EDTA、CTAB、SDS、纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶和蛋白酶K(分析純) 均購買于上海生工生物工程有限公司(中國上海)。

PCR儀 美國S 100 TM Thermal Cycler Bio-Rad公司;Gel DocTM XR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;TGL 16M高速冷凍離心機 湘麓離心機儀器公司;手提式高壓滅菌鍋 上海醫療衛生儀器廠;Illumina Miseq測序儀 美國Illumina;Nanodrop NC2000微量UV分光光度儀 Thermo Scientific(上海)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 為了解MBQ在醬香型大曲的特殊性,參考DB52/T 871-2014,從其曲表、黑臺層、曲底和曲心等4個顏色不同部位取樣;其余5種不同樣品則分別從其曲表和曲心取樣。采用4點取樣法分別從樣品部位的各位點取樣,混合均勻后取100 g用于分析。各樣品的詳細信息見表1。

表1 各樣品信息Table 1 Information of various samples

1.2.2 DNA提取 樣品的菌體收集、DNA提取參考Zhang等[15]方法完成。主要步驟如下:稱取5 g大曲和3 g玻珠置于50 mL滅菌的離心管中,加入25 mL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.1 mol/L,pH8.0),渦旋5 min,離心10 min(1000 r/min,4 ℃)收集上清液,重復3次,匯集所得的上清液。然后將其離心10 min(12000 r/min,4 ℃)收集菌團,-20 ℃保存待用。凍融研磨加酶助法提取DNA。DNA提取液為 0.1 mol/L Tris-HCL(含0.1 mol/L EDTA,1.5 mol/L NaCl,1% CTAB,pH=8.0),混合酶液由纖維素酶(75 mg/mL)、蝸牛酶(50 mg/mL)和溶菌酶(50 mg/mL)組成。提取的DNA經2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測和微量UV分光光度儀定量。

1.2.3 PCR擴增 分別用通用引物520F/802R和ITS2/ITS5擴增細菌V3-V4和真菌ITS1變異區。PCR體系:0.5 μL DNA聚合酶,5 μL 5×buffer,5 μL 5×High GC buffer,0.5 μL DNTP(10 mmol/L),1 μL DNA模板,1 μL正向引物(10 mmol/L),1 μL反向引物(10 mmol/L),11 μL ddH2O。PCR程序:98 ℃,30 s;(98 ℃,15 s;50 ℃,30 s;72 ℃,30 s)×27,72 ℃,5 min,4 ℃,反向。

1.2.4 樣品PCR純化及測序 委托上海派森諾生物科技有限公司對PCR產物純化,并使用Illumina MiSeq 2×300 platform(Illumina Inc,San Diego.CA)測序。

1.3 數據處理

使用QIIME(v1.8.0,1http://qiime.org/)完成過濾及去除嵌合體,具體操作是:去除5′端引物錯配堿基>1的序列和含有N(模糊堿基)的序列;去除含量連續相同堿基數>8的序列,及USEARCH(v5.2.236,http://www.drive5.com/usearch)推測的嵌合體。經UCLUST(v1.1.579)對相似長度≥150 bp及相似度≥97%聚類為相同的操作單元(operational taxonomic units,OUT),隨后根據Greengenes(Release 13.8 http://greengenes.secondgenome.com)和UNITE數據庫(Release 5.0,https://unite.ut.ee/),進行不同水平的分類(界、門、綱、目、科、屬、種)。分別用Mothur(v1.31.2)和QIIME(V1.8.0,http://qiime.org/)評估OTUs豐度≥0.5%α-和β-多樣性。應用R軟件(https://www.r-project.org/)完成熱圖,實現可視化及聚類和非度量多維測度分析。

2 結果與分析

2.1 PCR電泳結果

如圖1所示,樣品中微生物總DNA的真菌ITS1和細菌V3-V4變異區的PCR結果的條帶清晰度和DNA電泳位置分別在300、500 bp左右,滿足后續檢測結果的要求。

圖1 ITS1和V3-V4基因片段區PCR擴增結果Fig.1 PCR results of ITS and V3-V4 gene region注:(a)和(c):ITS1基因片段PCR擴增結果;(b)和(d):V3-V4基因片段區擴增結果。

2.2 群落α和β多樣性的時空性特征

本研究中的菌株序列已經提交到GenBank(美國)數據庫,申請得到國際基因庫接受號:SRP135846。

如表2所示,14個樣品有效的細菌和真菌序列分別為36082～51255和48640～81082,高質量序列平均數分別是37912、60641,是有效平均序列的85.97%和96.86%。微生物累積曲線隨著測序的樣本數的增加漸變平緩(圖2),表明測序樣本數能反映其群落結構的特點。不同生產區域、產地和陳曲時間及部位的樣品間α多樣性差異明顯(表3)。除了MBQ和LEQ,曲心中細菌的物種豐富度指數高于曲表;除了MEQ,曲心中真菌的物種豐富度指數也高于曲表。相應地,除了MBQ,曲心中的細菌多樣性指數略高于曲表,MBQ和LEQ等樣品的曲心中的真菌多樣性指數也略高于曲表。陳曲過程中(從3個月延長到6個月)曲心的細菌豐富度和多樣性指數都增高,而曲表則相反,同時,曲心和曲表的真菌物種豐富度指數都略減。

圖2 樣品的細菌(a)和真菌物種(b)累積曲線Fig.2 Specaccum curve based on the observed bacterial(a)and fungal(b)quantity

表2 不同醬曲樣品之間高質量真菌和細菌序列數的差異Table 2 Difference of high quality sequence based on 16S rRNA and ITS

表3 樣品間微生物群落的α-多樣性的差異Table 3 Difference of α-diversity among samples

測序結果表明,這些樣品的細菌包括6個門,分別是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和柔膜菌門(Tenericutes),真菌則包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌類(Zygomycota)及未確定群類。其中Firmicutes和Ascomycota分別是豐度最高細菌和真菌。不同種類大曲的曲心和曲表間的細菌和真菌群落差異明顯。Firmicutes和Proteobacteria的豐度之和超過細菌豐度的89.30%,而Ascomycota、Basidiomycota的豐度之和高于真菌豐度的94.04%。豐度高于1%以上的屬水平種類熱圖聚類分析的結果(圖3)表明,曲心和曲表群落結構差異明顯。MBH的細菌群落單獨聚為一類,而其真菌群落則與MBA和XTH的聚為一類,其中MBH和MBA則又聚為一亞類。樣品的細菌聚類的另一族中,曲心和曲表分別歸類為兩個亞族,其中LEA和LGA聚為一個子族,XXA和XTA聚在一起,曲心則僅有XXH和MEH聚在一起。同樣地,真菌群落熱圖分析中另一族的樣品中,XXA和XTA相鄰,且與LGH聚在同一子族,LEH和LEA相鄰,且與XXH聚在一小類中。顏色由深至淺表示的樣品間,各種屬水平微生物的OTU相對含量大小表明其差異性分布特點。

圖3 不同樣品的優勢菌(OUT>1%)的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of dominant microbial community(OUT>1%)among the various samples 注:(a):細菌,(b):真菌;*表示該微生物科中某一特定的屬(目前沒有統一命名)。

NMDS分析的結果進一步揭示了樣品群落結構的差異。除茅臺原產地大曲曲心,其余5種大曲樣品的曲心的真菌和細菌物種種類組成類似,但曲表樣品的組成則呈現較大差異(非加權NMDS,圖4a和圖4c),LGA和MEA較為近似。但各物種數量則是在曲心間差異顯著,而曲表間類似(加權NMDS,圖4b和圖4d)。MBQ中微生物群落中物種數量及各屬水平微生物物種數及數量均差異明顯。

圖4 NMDS排序結果圖Fig.4 Non-metric multidimensional ordination result graph注:(a)細菌非加權;(b)細菌加權;(c)真菌非加權;(d)真菌加權。

2.3 群落中的優勢菌的時空性特征

在這些樣品中檢出了116個不同的細菌屬和61個的真菌屬,分別屬于20個細菌目,21個真菌目(圖5)。優勢的細菌屬(OTU>1%)屬于芽胞桿菌目(Bacillales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、放線菌目(Actinomycetales)和乳酸桿菌目(Lactobacillales)等4個不同的目,其豐度之和超過96.84%,與Wang等[4]和Liu等[5]的報道結果是一致的,但樣品間優勢菌的豐度的差異明顯。除LEQ和LGQ以外,Bacillales和Lactobacillales分別在曲心和曲表中占優勢,前者在曲心的比例為24.71%～68.59%,后者在曲表中為55.89%～80.91%。

曲表的優勢細菌屬，其種類差異較小,腸球菌屬(Enterococcus)是除LGA和LEA外的優勢菌(55.89%～80.91%),而腸桿菌科未定屬(Enterobacteriaceae_G,59.61%)和芽胞桿菌科未定屬(Bacillaceae_G,57.77%)分別是LEA和LGA中最優勢的細菌屬。乳酸是Enterococcus和Enterobacteriaceae的主要代謝產物之一。乳酸不僅是乳酸酯前體,且具有抑制雜菌等作用,所以在醬香大曲酒生產過程中Enterococcus和Enterobacteriaceae的貢獻待深入研究。與曲表樣品不同,不同醬香型大曲曲心樣品中優勢的細菌屬種類差異明顯。Bacillaceae_G是在曲心樣品中的主要優勢菌,豐度為24.71%～68.59%,此外Bacillus、Staphylococcus和Thermoactinomyces等在取心中的豐度同樣較高,其中Bacillus是既能合成吡嗪類等醬香型大曲酒特殊組分的生物合成者[7,10,16],又產水解酶類[17]。雖然已在濃香和醬香型大曲及多種傳統發酵食品中檢出了Staphylococcus[18],但其作用尚待深入探討。Thermoactinomyces作為大曲中優勢細菌[13,18-19],產生各種水解酶,如堿性磷酸酶、酯化酶、液化酶和磷酸水解酶等[20],在白酒釀造過程中具有重要的作用。

茅臺大曲的曲心樣品(MBH)中優勢細菌包括Staphylococcus、Bacillus、動球菌科未定屬(Planococcaceae_G)和Bacillaceae_G等,其豐度分別是38.70%、11.19%、4.33%和39.55%,后二者在在MEH也是優勢菌屬,其豐度分別占66.32%和10.25%。在MBC中,片球菌屬(Pediococus)和Enterococcus豐度分別是66.12%和11.09%,而在MBD中,這二者及乳酸桿菌科未定屬(Lactobacillaceae_G)、明串珠菌科未定屬(Leuconostocaceae_G)的豐度分別是43.01%、22.16%、14.87%和16.33%。LEH中的Thermoactinomyces、Bacillaceae_G和Enterobacteriaceae_G的豐度分別是38.35%、30.95%和10.49%。LGH中的歐文氏菌屬(Rwinia)和Enterobacteriaceae_G的豐度分別是32.07%和27.06%。增加3個月時間后,曲心中優勢細菌的構成發生顯著變化,除Bacillaceae_G外,XTH的優勢菌屬是Thermoactinomyces(15.52%),而在XXH中,Planococcaceae_G(10.87%)和Enterobacteriaceae_G(16.82%)是優勢菌。

如圖5b所示,醬香型大曲中的優勢真菌屬包括木霉屬(Trichoderma)、假絲酵母(Candida)、曲霉菌(Aspergillus)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoacus)、擬青霉屬(Paecilomyces)和絲孢酵母屬(Trichosporon)等7個不同屬,其豐度在74.80%～97.88%間。乙醇、異戊醇和苯乙醇是Candida主要代謝產物[21],而包括蛋白酶和淀粉酶在內的水解酶是Aspergillus是代謝產物,且這些真菌還產生多種揮發組分及前體[22]。Thermomyces、Thermoacus和Trichoderma等菌則與纖維素降解酶(纖維素酶及葡萄糖苷酶等)及淀粉水解酶(葡萄糖)的合成有關[23-25]。盡管Trichosporon在釀酒過程的作用尚不清楚,但產脂肪酶及酯化能力還是引人關注[26]。

圖5 樣品中優勢種屬組成輪廓圖(OUT>1%)Fig.5 Dominant microbial community profiles in various samples(OUT>1%)注:a:細菌,b:真菌,*表示表示該微生物科中某一特定的屬(目前沒有統一命名)。

在MBH和MBA中,Aspergillus的豐度分別是32.61%和64.83%,此外在前者Candida(32.25%)和Trichoderma(16.79%)也是優勢菌。Candida在MBC(75.87%)和MBD(43.27%)的豐度差異顯著,同時Thermomyces在后者的豐度是21.23%。由此可見,茅臺大曲中的Aspergillus、Candida、Trichoderma和Thermomyces等4個屬真菌為優勢菌。同企業因生產區域及產地不同,其樣品的優勢真菌豐度也有較大差異。如MBH的Trichoderma和Aspergillus的豐度分別是16.79%和32.61%,MEH中為45.58%和1.40%,在MBA和MEA中Trichosporon的豐度分別是6.57%和30.55%。類似的,LEQ和LGQ曲心和曲表樣品間Trichoderma、Aspergillus、Thermoacus和Paecilomyces的豐度也有較大差異。增長3個月陳曲時間,優勢真菌的豐富度發生明顯改變,其中嗜熱真菌屬(Thermomyces)和嗜熱子囊菌屬(Thermoacus)的豐富度增加,木霉屬(Trichoderma)和絲孢酵母屬(Trichosporon)則減少。木霉屬(Trichoderma)在曲心中增高,但在曲表中則減少,假絲酵母(Candida)在曲心中顯著增高,但在曲表中略減少。

3 結論

應用宏基基因測序技術剖析產地、不同企業、生產場地及陳曲時間對醬香型大曲群落組成及群落多樣性的特征,結果表明,醬香型大曲的優勢細菌主要包括由Bacillales、Enterobacteriales、Lactobacillales和Actinomycetales等4個目,而優勢真菌則是Saccharomycetales、Hypocreales、Eurotiales和Trichosporonales等4個目,茅臺大曲中Staphylococcus、Bacillus、Pediococus、Candida和Aspergillus的豐度高于其它5種大曲的,而其它5種大曲的群落結構組成及多樣性也差異明顯,陳曲時間明顯地影響群落的多樣性。測序結果的NMDS分析表明,除茅臺原產地大曲曲心,各種大曲樣品的曲心的真菌和細菌物種種類組成類似,但優勢物種種類差異較大;相反,曲表的微生物組成種類差異較大,但共有優勢物種種類及豐度相似。其結果揭示了醬香型大曲的微生物群落具有顯著的時空性特征。