刺梨白粉病拮抗菌的篩選及其抑菌機制初探

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(1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025; 2.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025; 3.貴州理工學院制藥工程學院,貴州貴陽 550003)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)屬于薔薇科薔薇屬,多年生灌木落葉繅絲花的果實,富含豐富的纖維素、黃酮、維C和多酚類物質[1],是貴州一種集聚品質和觀賞價值的區域特色藥食兩用新資源植物。刺梨在貴州很多地區均有種植,如六盤水、畢節,安順、織金等,隨著刺梨成分研究的深入,越來越多的刺梨產品出現,如刺梨干、刺梨飲料、刺梨酒以及刺梨餅干等[2],刺梨的需求也越來越大。白粉病(Sphaerothecapannosa)作為刺梨的一種常見真菌性病害[3],病菌可浸染所有的綠色組織,病變組織呈灰白色斑塊,導致果實果粒不膨大或者萎縮,是影響產量的重要病害之一。其在瓜類、葡萄、小麥、玫瑰等很多植株生長過程均能侵染植株[4]。病原菌一般以孢子的形態潛伏于土壤和殘枝廢葉中,在每年的4 月上、中旬開始病發,到6月白粉病發生較重,7月以后隨著葉片的老化,病情逐漸下降,影響刺梨的生長、開花和結果整個階段[5]。

目前,刺梨白粉病的防治措施主要是噴灑15%粉繡寧(三銼酮),化學名稱是1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H,1,2,4-三唑-1-基)-2-丁酮,其對由真菌引起的病害有一定的治療作用。研究發現,粉繡寧藥效持續時間長,需要控制采收季節噴灑;其次施藥后會抑制莖芽葉的生長、葉片變小、植株生長緩慢甚至停止生長;此外,對皮膚和眼睛有刺激性,對人畜有低毒[6]。隨著三銼酮的長期使用,極大可能會使得刺梨產生抗病性,因此生物防治應用的需要也迫在眉睫。生物防治是利用生物物種間的關系,以一種生物抑制另一種生物,具有高效、環保、安全等特點。作為生物防治劑的微生物叫拮抗菌,拮抗菌的篩選是研究生物防治的關鍵,其主要來源于土壤和植株表面,能抑病原菌生長繁殖且不會對植物生長和發育造成影響,Prashar等[7]報道生防菌對植株生長和功能不僅不會造成影響,還能抑病原菌生長繁殖。拮抗菌用于植物病害防治已得到大量的研究證實,很多新成果在不斷的涌現。Lin Li等[8]研究發現蘇云金芽孢桿菌生物農藥在我國得到了規模生產應用;祝學海等[9]從半夏根際土壤篩選對半夏塊莖腐爛病病原菌有拮抗活性的細菌;Xu S J等[10]發現芽孢桿菌對番茄灰霉病具有生物防治作用等。生物防治在植物病害防治上的應用越來越廣,關于刺梨白粉病的生物防治方法鮮少,有待進一步開展實驗。

試驗擬從健康刺梨枝葉及其根系土壤分離篩選對刺梨白粉病病原菌有防治效果的拮抗菌;通過形態學、生理生化鑒定以及分子生物學鑒定刺梨白粉病拮抗菌;通過葉盤實驗檢測不同濃度拮抗菌溶液的對刺梨白粉病的防治效果并繪制拮抗菌生長曲線觀察生長趨勢;研究拮抗菌對白粉病菌絲及其孢子萌發的影響,同時探究拮抗菌代謝抗性相關酶的情況,為刺梨白粉病的生物防治提供新的菌種資源和理論依據,以及為進一步生物防治應用奠定基礎。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

無籽金刺梨植株 貴州畢節刺梨種植基地;刺梨白粉病病原菌(Sphaerothecapannosa) 貴州大學釀酒與食品工程學院發酵工程與生物制藥重點實驗室分離保藏;牛肉膏蛋白胨固體培養基(NA)、牛肉膏蛋白胨液體培養基(NB)、苯并咪唑培養基(50 mg苯并咪唑,5 g瓊脂,1 L蒸餾水溶解)、酪蛋白培養基、纖維素剛果紅培養基、果膠培養基、幾丁質培養基 上海博威生物科技有限公司;苯并咪唑,瓊脂,無水乙醇,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉,戊二醛 上海博威科技有限公司;實驗所用試劑 均為分析純;天根細菌DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;PCR聚合酶 寶生物工程(大連)有限公司。

TOMY高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY;SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠;SwCJ-lF型超凈工作臺 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;恒溫培養搖床 上海諾晶生物科技有限公司;CK31型倒置顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司;S-3400N掃描電子顯微鏡 HITACHI(日立)公司;721型可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司;FA1004N型電子天平 上海精密儀器儀表有限公司;2720型PCR儀 美國 ABI 公司;RJ-TGL-16G離心機 北京瑞邦興業科技有限公司;DHG-9015A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海圣科儀器設備有限公司;1-4/LDC-1M冷凍干燥儀 博勵行儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 拮抗菌的篩選

1.2.1.1 刺梨白粉病菌的培養 春天種植半年生刺梨苗盆栽若干,三株刺梨苗用于白粉病菌的培養,孢子抖落接種于刺梨苗,于20 ℃左右培養5～7 d至葉片表面長出病斑,取孢子配制單位為105個/mL懸液備用,用于下文的葉盤實驗。

1.2.1.2 拮抗菌的分離純化 取健康植株的枝葉1 g剪碎，用無菌水沖洗3～4次,浸泡于50 mL無菌水中25 ℃搖床2 h,同時取1 g根系土壤研磨,加50 mL無菌水25 ℃搖床2 h;取上清液分別稀釋10-1、10-2、10-3倍并涂布培養于NA固體培養基上37 ℃培養12 h,挑取形態不同的菌落劃線培養至單菌落,純化保藏備用。

1.2.1.3 拮抗菌發酵液的制備 分離純化的形態不同的細菌液體培養,分別配制成108CFU/mL的種子液,分別取5 mL的種子液接種于100 mL的NB培養基中,37 ℃搖床培養24 h后得到發酵液。

1.2.1.4 篩選 采用葉盤實驗進行篩選[11],剪取1.2.1.1盆栽健康刺梨的葉片無菌水沖洗,于無菌操作臺上用直徑10 mm的打孔器制成葉盤,浸泡于1.2.1.3得到的不同細菌發酵液中12 h后,取出正面朝上貼于苯并咪唑培養基上,每個培養基貼6片,并噴灑1.2.1.1所得的10 mL孢子懸浮液,置于光照培養箱28 ℃培養5～6 d后肉眼觀察病斑;空白對照組的葉片無需細菌發酵液的浸泡。通過病級指數篩選拮抗菌,病級指數表示葉盤實驗中病斑面積,分級標準:0級未感染病菌;1級(+)病斑面積占5%以下;2級(++)病斑面積占5%～25%;3級(+++)病斑面積占25%～50%;4級(++++)病斑面積占50%以上。

1.2.1.5 不同濃度拮抗菌的抑制效果 將篩選得到的拮抗菌制備成不同菌懸液濃度108、106、104CFU/mL的發酵液,進行葉盤實驗,通過計算病情指數和防治效果分析不同濃度拮抗菌的抑制效果[12]。

病情指數(%)=[∑(病級指數×代表數值)]/(總株數×發病最重級的代表指數)×100

防治效果(%)=(對照病級指數-處理病級指數)/對照病級指數×100

1.2.2 拮抗菌的鑒定

1.2.2.1 形態學鑒定 拮抗菌培養于NA培養基上37 ℃培養24 h后觀察單菌落外觀形態;顯微鏡進一步觀察微觀形態特征;掃描電鏡進一步觀察形態特征[13]。

1.2.2.2 生理生化鑒定 參照文獻[14]選取氧化酶、過氧化氫酶、Kovacs吲哚、M-R、V-P、苯丙氨酸脫氨酶、明膠液化、硫化氫等9項生理生化指標,采用細菌微量生化鑒定管進行鑒定。

1.2.2.3 拮抗菌 液體培養篩選得到的拮抗菌,16S rRNA序列分析拮抗菌培養液,收集菌體提取DNA,采用16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3′)進行擴增,PCR特異性產物送天霖生物科技有限公司測序,得到目的片段的堿基序列,根據NCBI獲得的BLAST結果,結合系統發育樹進行同源性分析。

1.2.2.4 拮抗菌JK-6和JK-32的生長曲線繪制 參照文獻[15]的方法進行,取JK-6和JK-32的種子液,按5%接種量接種于500 mL的NB液體培養基三角瓶中,混勻后平均分裝試管50支試管中,先取兩支試管中的菌液測OD600的吸光度為零,其余標記好置于37 ℃搖床中140 r/min振蕩培養,之后每1 h取兩支試管的菌液測OD600值。記錄數據繪制生長曲線。

1.2.3 拮抗菌的抑菌機制初探

1.2.3.1 拮抗菌對白粉病孢子萌發率的影響 配制2%的瓊脂溶液,拮抗菌發酵液稀釋菌濃度為108、107、106、105CFU/mL,分別取10 mL的發酵液、10 mL瓊脂溶液和1 mL白粉病菌孢子懸浮液混合,將混合液分別滴加與載玻片中央制成圓形培養基編號,空白對照組用10 mL的蒸餾水、10 mL瓊脂溶液和1 mL孢子懸浮液混合滴加到載玻片中央制備培養基。28 ℃下光照培養,分別于24 h顯微鏡觀察孢子萌發情況(孢子芽管大于孢子短半徑的視為萌發)、測量芽管長度,觀察的孢子數不小于100個,實驗重復3次,計算萌發率:

萌發率(%)=(對照孢子萌發率-處理孢子萌發率)/對照孢子萌發率×100

1.2.3.2 拮抗菌對白粉病菌絲的影響 剪取健康盆栽刺梨大小相似的葉片,分別浸泡于拮抗菌發酵液中,12 h后取出正面朝上貼于苯并咪唑培養基上,每個培養基貼2片,并噴灑10 mL孢子懸浮液,置于光照培養箱28 ℃培養12～24 h后,挑取單病斑菌絲與顯微鏡下觀察菌絲形態變化,空白對照組的葉片無需浸泡發酵液。

1.2.3.3 拮抗菌產酶情況的探究 參照關小敏等[16]。蛋白酶定性檢測:蛋白酶通過酪蛋白培養基平板檢測,在固體培養基上放置直徑為5 mm的濾紙片,取10 μL的1.2.1.3得到的拮抗菌發酵液滴到濾紙片上,分別做三個平行,置于培養箱37 ℃培養24 h觀察是否有透明圈。

纖維素酶定性檢測:纖維素酶通過纖維素剛果紅培養基檢測,在不加剛果紅的纖維素固體培養基上放置5 mm的濾紙片,取10 μL的拮抗菌發酵液滴到濾紙片上,分別做三個平行,置于培養箱37 ℃培養24 h后,用1%剛果紅溶液染色30 min,再用1% NaCl脫色,觀察是否有透明圈。

果膠酶定性檢測:果膠酶通過果膠培養基檢測,在固體培養基上放置直徑為5 mm的濾紙片,取10 μL的拮抗菌發酵液滴到濾紙片上,分別做三個平行,置于培養箱37 ℃培養24 h觀察是否有透明圈。

幾丁質酶定性檢測:幾丁質酶通過幾丁質培養基檢測,在固體培養基上放置直徑為5 mm的濾紙片,取10 μL的拮抗菌發酵液滴到濾紙片上,分別做三個平行,置于培養箱37 ℃培養24 h觀察是否有透明圈。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復三次,采用SPSS 17.0軟件進行數據的顯著性分析,應用Origin 8.5和MEGA5制作圖表。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的篩選結果

經過對健康刺梨枝葉及其根系土壤分離共得到48株細菌,初篩結果(表1)表明,對比空白對照有21株細菌的病級指數小于5級,其中JK-6和JK-32具有較好的拮抗效果。為了考察不同濃度拮抗菌的防治效果,使用不同濃度菌液進行葉盤實驗,結果如表2,拮抗菌JK-6和JK-32的不同濃度發酵液對葉盤的病情指數以及防治效果有差異。對比空白對照83%的病情指數,JK-6和JK-32溶液濃度為108CFU/mL時病情指數低至32%和35%,顯著低于空白對照組(p<0.05),防治效果也達到了60%和57%。

表2 不同溶液濃度拮抗菌發酵液對刺梨白粉病葉盤防治效果Table 2 Antagonistic bacteria fermentation at different dilutions on Cili powdery mildew leaf disc prevention and treatment

表1 不同細菌對刺梨白粉病的病級指數Table 1 Infected index of bacterine powdery mildew by different bacteria

2.2 拮抗菌的鑒定結果

2.2.1 形態學鑒定 由圖1可知,菌落呈圓形隆起、乳白色、不透明、表面有皺褶且干燥、粘稠厚重、菌體呈橢圓桿狀,大小為長徑1.3～1.5 μm、短徑600～800 nm,需氧型革蘭氏染色陽性菌;JK-32在LB平板上37 ℃培養24 h后，菌落呈圓形無隆起且菌落濕潤、有皺褶、不透明、奶白色、菌體呈桿狀,長徑2.1～2.3 μm、短徑為750～760 nm。

圖1 拮抗菌JK-6和JK-32的形態學圖Fig.1 Morphology of antagonistic bacteria JK-6 and JK-32注:A:JK-6的單菌落;B:JK-6顯微鏡圖(40×);C:JK-6的電鏡圖;D:JK-32的單菌落;E:JK-32顯微鏡圖(40×);F:JK-32的電鏡圖。

2.2.2 生理生化鑒定 JK-6和JK-32的主要生理生化特征見表3,根據JK-6和JK-32的菌落形態和生理生化特征,參照《細菌鑒定手冊》可以初步推斷為芽孢桿菌屬,具體判斷需要進一步進行16S rDNA序列測定。

表3 JK-6與JK-32的各項生理生化檢查結果Table 3 Results of physiological and biochemical tests ofJK-6 and JK-32

2.2.3 拮抗菌16S rRNA 序列分析 提取兩株拮抗菌的基因組,分別進行16S rRNA序列擴增[17],目的片段約1400 bp[18]。JK-6和JK-32經PCR擴增均得到單一條帶(圖2),PCR產物進行測序。將測序結果與NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫進行同源性比對。比對結果顯示JK-6的序列與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens/GenBank登錄號:MPA 1034)菌株的16S rRNA基因序列相似度高達99%。將JK-6的16S rRNA 序列在BLAST分析后結果進行系統發育樹的構建,如圖3所示,JK-6與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)處于最小分支,親緣關系最近,結合形態學和生理生化特征,將JK-6鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。比對結果顯示JK-32的序列與空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius/GenBank登錄號:NR118439)的相識度到達了100%。將JK-32的16S rRNA序列在BLAST分析后結果進行系統發育樹的構建,如圖4所示,JK-32與Bacillusaerius處于最小分支,親緣關系最近,結合形態學和生理生化特征,將JK-32鑒定為空氣芽孢桿菌Bacillusaerius。

圖3 JK-6基于16S rRNA 序列系統發育樹Fig.3 JK-6 phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence

圖4 JK-32基于16S rRNA序列系統發育樹Fig.4 JK-32 phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence

圖2 JK-6和JK-32拮抗菌16S rRNA PCR產物核酸電泳圖Fig.2 JK-6 and JK-32 antagonistic bacteria 16S rRNA PCR products注:1～3:JK-32;4～6:JK-6;7:DL2000。

2.2.4 JK-6與JK-32生長曲線的繪制結果 繪制JK-6和JK-32的生長曲線如圖5所示,JK-6在0～5 h屬于延滯期,5～17 h處在對數生長期,17～21 h屬于穩定期,21 h以后進入衰亡期;JK-32在0～5 h屬于延滯期,5～16 h處在對數生長期,16～20 h屬于穩定期,20 h以后進入衰亡期。對比JK-6和JK-32的生長曲線,J兩株菌的生長周期相似,但JK-6的生長能力較JK-32強。

圖5 拮抗菌JK-6和JK-32的生長曲線Fig.5 Antagonistic growth curve of bacteria JK-6 and JK-32

2.3 拮抗菌對白粉病菌孢子萌發率的影響

如表4所示,隨時間的變化和拮抗菌發酵液濃度的不同,對白粉病的萌發抑制程度也不一樣。結果表明,在12 h和24 h后,顯微鏡下的觀察結果顯示,拮抗菌JK-6和JK-32對刺梨白粉病的孢子萌發均有抑制作用。空白培養24 h后孢子的平均萌發率為85.0%,孢子芽管平均長度為64.3 μm;而在拮抗菌JK-6和JK-32濃度為108CFU/mL發酵液處理24 h后,孢子萌發率分別為20.1%和25.0%,芽管長度分別為11.0 μm和9.3 μm,顯著低于空白對照組(p<0.05)。對比正常萌發孢子圖片(圖6),拮抗菌處理過的萌發孢子數量減少,其中JK-6抑制的作用更強。

表4 不同濃度拮抗菌發酵液對刺梨白粉病孢子萌發的影響Table 4 Effects of fermentation solution with different concentration of antagonistic bacteria on spore germination of powdery mildew

圖6 拮抗菌JK-6和JK-32對白粉病孢子萌發抑制圖Fig.6 Inhibition of spore germination of powdery mildew by antagonistic bacteria JK-6 and JK-32注:A:健康孢子24 h萌發圖;B:濃度為108 CFU/mL的JK-6發酵液處理24 h孢子萌發圖;C:濃度為108 CFU/mL的JK-32發酵液處理24 h孢子萌發圖。

2.4 拮抗菌對白粉病菌菌絲的影響

使用顯微鏡觀察被拮抗菌感染過的白粉病致病菌的菌絲結構,如圖7所示,對比正常的菌絲,菌絲體在顯微鏡下都出現異常現象。圖中A、D為健康菌絲,其中A是由一個單孢子萌發產生的菌絲體,菌絲健康且表面光滑、圓潤;圖B中菌絲在拮抗菌的作用下表面變的粗糙,圖C中菌絲體異常膨大,圖E中菌絲纏繞打結,圖F中出現融斷現象。這可能與拮抗菌在生長發育過程中代謝產生的酶或者抗菌類物質有關[24-28]。

圖7 拮抗菌對刺梨白粉病菌絲影響Fig.7 Antagonistic bacteria against powdery mildew mycelium注:A、D:健康菌絲;B、C、E、F:拮抗菌處理后發生畸變的菌絲。

2.5 拮抗菌的產酶情況探究結果

對拮抗菌JK-6和JK-32的四種抗性相關酶進行定性檢測,結果如圖8所示,拮抗菌JK-6和JK-32對酪蛋白、纖維素以及果膠有分解作用,且JK-6的能力較JK-32的強,JK-6和JK-32在幾丁質培養基上沒有顯示透明圈,證明其未能產生相應的酶降解幾丁質。

圖8 拮抗菌JK-6和JK-32產酶情況Fig.8 Antagonistic bacteria JK-6 and JK-32 enzyme production situation注:A:蛋白酶抑菌圈;B:纖維素酶抑菌圈;C:果膠酶抑菌圈;D:幾丁質培養基;6:拮抗菌JK-6;32:拮抗菌JK-32。

3 討論

實驗分離得到JK-6和JK-32兩株拮抗菌,分別鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius)。拮抗菌JK-6和JK-32對刺梨白粉病病原菌的防病效果到了60%和57%,驗證了JK-6和JK-32對刺梨白粉病病原菌有抑制作用,并進一步證明了拮抗菌JK-6和JK-32對病菌的孢子和菌絲均有抑制作用,同時證明了兩株拮抗菌均能產生蛋白酶、纖維素酶、果膠酶。JK-6和JK-32都屬于芽孢桿菌屬,現有的研究表明,芽孢桿菌能夠分泌多種抑菌物質,抑制病原菌的生長代謝[19]。

芽孢桿菌作為生物防治的主要細菌,對很多病菌具有拮抗作用,主要與其代謝產生的脂肽類物質、抗生素、揮發性物質以及水解酶類有關。Rahman等[20]發現芽孢桿菌作為生物防治劑代替了合成殺蟲劑防治由核盤引起的白斑病;向亞萍等[21]報道芽孢桿菌的抑菌活性與其產脂肽類抗生素相關;Kumar V等[22]從發酵食品中分離得到一株高產細菌素的桿菌,具有很強的抗菌性能;Raza等[23]發現解淀粉芽孢桿菌產生的揮發性有機物對番茄青枯病病原菌有抑制作用;Yuting等[24]報道了一株芽孢桿菌的發酵產物對番茄早疫病病原菌的菌絲和孢子均有抑制作用。Gul等[25]報道枯草芽孢桿菌代謝產蛋白酶與其生物防治功能相關;GO等[26]研究發現芽孢桿菌S8具有角質分解和抗真菌活性;Brack C等[27]報道短小芽孢桿菌在代謝過程中能產生細菌分解酶并在檸檬酸桿菌溶菌過程起作用。Souza Fabiana等[28]發現解淀粉芽孢桿菌可作為纖維蛋白溶解酶的生產者,并有并有望成為治療血管疾病的有力藥物。本實驗發現分離得到的拮抗菌具有產纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的能力,這將對拮抗菌抑菌機制做進一步研究奠定了基礎,同時也需要對發酵液中是否有抑菌活性物質進行繼續探究,為今后實驗做了鋪墊。

4 結論

本實驗從健康刺梨及其根系土壤分離得到兩株拮抗菌JK-6和JK-32,通過進行形態學、生理生化和細菌16S rRNA基因序列分析,鑒定JK-6和JK-32兩株拮抗菌分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius);通過葉盤實驗結果表明JK-6和JK-32對刺梨白粉病有防治效果,發酵原液防治效果到達了60%和57%;JK-6和JK-32的生長曲線繪制結果顯示,兩株菌都在在培養16～17 h后進入穩定期,20～21 h后進入衰亡期;JK-6和JK-32對白粉病孢子萌發有抑制作用,同時對菌絲有畸變效果;產酶實驗結果表明，兩株拮抗菌均可產生蛋白酶、纖維素酶和果膠酶。