克氏原螯蝦殼膜幾丁質酶的分離純化

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(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306; 3.國家淡水水產品加工技術研發分中心(上海),上海 201306)

幾丁質是N-乙酰葡糖胺通過β-1,4糖苷鍵連接聚合而成的不溶性多糖。是自然界中最豐富的多糖之一,主要構成真菌細胞壁[1],以及一些節肢動物的角質層和外皮[2]。幾丁質酶廣泛存在于各種生命體中,從微生物、動植物到人類均能產生幾丁質酶,參與多種生物過程,包括幾丁質食物消化,形態發生,發病機理和防御帶有幾丁質的病原體等。幾丁質酶酶系包括幾丁質內切酶、外切酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶,只有這三種酶協同發揮作用,才能將天然存在的幾丁質酶徹底分解為單糖[3-4]。

目前幾丁質酶在食品、醫療及環保等諸多行業開始逐漸發展起來,具有廣泛的應用,如在生物防治方面,幾丁質酶可作為保護植物的化學農藥替代品,由于幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分,可借助基因工程將幾丁質酶基因導入植物細胞,培育出可以抑制病原真菌侵襲的轉基因植物。在藥物治療上,幾丁質酶可用于增強抗真菌藥物的活性,因此可添加在抗真菌乳膏和乳液中。另外有研究表明哺乳動物酸性幾丁質酶(AMCase)是控制哮喘疾病中的一個重要媒介[5]。在降解產物方面,甲殼動物約75%的總重量為下腳料,其中幾丁質占下腳料干重的20%～58%[6],所以生產幾丁質酶是利用好甲殼動物幾丁質下腳料的關鍵。目前關于甲殼動物幾丁質酶的研究主要包括蝦、蟹、鰓足蟲、溞等[7]。這些研究主要集中在微生物產酶、酶基因表達及克隆以及幾丁質酶在蛻殼中的生理作用等。有關體內天然幾丁質酶分離純化的研究不多,所采用的純化手段也不盡相同,但主要以凝膠層析、離子層析、親和層析居多。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii),也稱小龍蝦、紅螯蝦等,隸屬節肢動物門甲殼綱,是營養價值較高、具有一定保健作用的水產品[8]。克氏原螯蝦從幼蝦到性成熟要經過11次蛻殼[9]。隨著幾丁質酶基礎研究的日益發展,幾丁質酶的來源已經擴展到幾乎整個生物界,從富含幾丁質的甲殼動物體內提取幾丁質酶不失為一種產生幾丁質酶的理想來源,本文以克氏原螯蝦蝦殼為材料,分離純化幾丁質酶,以期為后續酶學性質的研究提供基礎，為不同生物來源的幾丁質酶系的性質和功能的比較研究提供借鑒,對于豐富幾丁質酶多樣性,提供充分的科研支持具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮克氏原螯蝦 上海古棕路菜市場;幾丁質 安徽酷爾生物工程有限公司;N-乙酰氨基葡萄糖苷 南京奧多福尼生物科技有限公司;Sephadex G-100葡聚糖凝膠填料、苯基疏水低取代填料、DEAE-32纖維素填料填料 購于GE公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)標準蛋白 購于生工;3,5-二硝基水楊酸、鹽酸、氯化鈉、硫酸銨、氫氧化鈉等 購于國藥公司,分析純。

SS250-E組織搗碎機 方勝電器實業有限公司;KYC-100C恒溫振蕩水浴鍋 上海新苗醫療器械制造有限公司;PHS-3C pH計 上海雷磁儀器公司;Sorvall Lynx 4000高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技;YC-2型層析實驗冷柜 北京博醫康實驗儀器有限公司;CHRIST ALPHA1-2冷凍干燥機 北京博勱行儀器有限公司;DYY-III型穩壓穩流電泳儀、DYCZ-24D型垂直板電泳槽 北京市六一儀器廠;UNICO UV-2000型紫外可見分光光度計 北京譜析通用儀器有限責任公司;TS-2000A型脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;凝膠成像儀 Bio-Rad公司;MALDI Biotyper飛行時間質譜儀 北京布魯克(BRUKER)科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠體幾丁質的制備 參照李奕雅[10]的方法作部分改動。10 g幾丁質緩慢加入到60 mL預冷的濃HCl中,4 ℃劇烈攪拌12 h,倒入1 L 4 ℃的95%乙醇中,磁力攪拌并室溫放置12 h,4 ℃、5000 r/min離心20 min,收集沉淀,蒸餾水洗至中性后用50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液配成1%膠體幾丁質。

1.2.2 粗酶液的制備 參照Koga等[11]、林建城[12]的方法作部分改動。將克氏原螯蝦解剖,操作過程中盡可能不破壞蝦殼內附著的一層殼膜,以W∶V=2∶1加入預冷的50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液，于高速組織搗碎機中勻漿1～2 min,放置4 ℃冰箱抽提過夜,10000 r/min下離心10 min,取上清液即得到粗酶液,分裝后置于-80 ℃冰箱內保存。

1.2.3 酶的分離純化

1.2.3.1 硫酸銨分級沉淀 取粗酶液進行硫酸銨分級沉淀。收集沉淀蛋白,用少量的50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液溶解,以相同緩沖液為外液進行充分透析,用等量1% BaCl2與透析外液混合,直至無白色沉淀為止為透析充分。

1.2.3.2 Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析 經透析除鹽后的酶液上樣于已用50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5,含有0.2 mol/L NaCl)緩沖液平衡好的凝膠層析柱,柱規格為1.6 cm×50 cm,流速為8 mL/h,自動收集,每管3.5 mL。檢測每管蛋白質含量和酶活力,收集酶活較高的洗脫峰。

1.2.3.3 苯基疏水層析 將1.2.3.2所得活力組分冷凍濃縮后加入硫酸銨調節其終濃度為1 mol/L,過0.45 μm濾膜后上樣于已用50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5,含1 mol/L硫酸銨)緩沖液平衡好的疏水層析柱,柱規格為 2.6 cm×7 cm,待上述緩沖液流洗去除不結合的雜蛋白之后，分別用含1～0 mol/L(間隔0.5 mol/L)硫酸銨的緩沖液階段梯度洗脫,流速為1 mL/min,自動收集,每管3 mL,檢測每管蛋白質含量和酶活力,收集酶比活較高的洗脫峰。

1.2.3.4 DEAE-32陰離子層析 經苯基疏水層析收集的酶液裝入透析袋,用50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液為外液進行充分透析,濃縮后過0.22 μm濾膜后，上樣于已用50 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液平衡好的離子層析柱,柱規格為2.6 cm×10 cm,分別用含0～0.6 mol/L(間隔0.2 mol/L)NaCl的緩沖液作階段梯度洗脫,流速為1 mL/min,自動收集,每管3 mL。測定每管蛋白質含量和酶活力,收集酶比活較高的洗脫峰。

1.2.4 蛋白質含量的測定

1.2.4.1 蛋白質標準曲線的測定 采用Folin-酚試劑法[13]測定蛋白濃度。精確稱取0.0300 g牛血清白蛋白溶解于離子水中,定容至100 mL,配成0.3 mg/mL的標準溶液。取該溶液稀釋成不同濃度:0.06,0.12,0.18,0.24,0.3 mg/mL。取不同濃度的蛋白標準溶液1 mL,分別加入5 mL Folin-酚A試劑,混勻后室溫放置10 min,再加入0.5 mL Folin-酚B試劑,立即搖勻,室溫放置30 min后于650 nm處測定吸光度值。以OD650為縱坐標,蛋白標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.4.2 樣品蛋白含量的測定 取1 mL稀釋一定倍數的酶液,按1.2.4.1中步驟加入Folin-酚各試劑,測定其OD650。根據1.2.4.1得蛋白質含量標準曲線方程為y=0.00231x,x代表蛋白質含量,y代表OD650,R2=0.9972,通過標準曲線公式計算可得出對應的蛋白質含量。

1.2.5 幾丁質酶活力測定

1.2.5.1 幾丁質酶活力標準曲線的測定 采用DNS法測定酶活力。精確稱取0.1000 g N-NAG溶解于去離子水中,定容至100 mL,配成1 mg/mL的N-NAG標準品。取該溶液稀釋成不同濃度:0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL。取不同濃度的N-NAG標準品1 mL,分別加入2 mL DNS試劑,煮沸5 min,冷卻至室溫后,于500 nm處測定吸光度值。以OD500為縱坐標,N-NAG濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.5.2 酶活體系的測定 以沸水浴煮沸5 min的熱變性酶為對照組,取1.5 mL膠體幾丁質與1 mL酶液混勻,40 ℃反應30 min后立即加入1 mL的2.0 mol/L NaOH溶液終止反應。取上述混合液1 mL,加入2 mL DNS試劑,沸水浴顯色5 min,冷卻后于10000 r/min離心10 min,取上清液定容至4 mL,測定500 nm處吸光度值。1個酶活力單位定義為:上述條件下,每毫升溶液中每分鐘水解膠體幾丁質釋放lμg的N-乙酰氨基葡萄糖(N-NAG)所需的酶量。根據1.2.5.1得N-NAG標準曲線方程為y=1.83x,x代表N-NAG含量,y代表OD500,R2=0.9906,通過標準曲線公式計算樣品酶液N-NAG的生成量而得出幾丁質酶活性。

1.2.6 酶相對分子質量和純度鑒定 分子質量測定結合SDS-PAGE和飛行質譜。SDS-PAGE:分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%,用標準蛋白質(14.4～97.4 KDa)作為參照,將幾丁質酶樣品與上樣緩沖液按比例混合,沸水浴煮沸5 min,冷卻后上樣。濃縮膠電流為15 mA,分離膠電流為30 mA。用1%考馬斯亮藍R-250對凝膠染色,根據已知分子量的標準蛋白在SDS-PAGE中的相對遷移率Rf,作Rf-lgMr圖,求得樣品相對分子質量;飛行質譜:取1 μL稀釋后的酶樣品與1 μL飽和CHCA基質溶液混勻,點在飛行質譜儀的ground steel靶板上,自然干燥后送入質譜儀中檢測。

1.3 數據處理

每次實驗結果均為3次測定求平均值。統計分析采用通用統計軟件Excel 2016。

2 結果與分析

2.1 純化結果

2.1.1 硫酸銨分級沉淀 克氏原螯蝦殼膜經Tris-HCl緩沖液抽提出粗酶液之后進行硫酸銨分級沉淀,從圖1可以看出隨著硫酸銨飽和度的增大,上清液中的蛋白含量和酶活力都呈下降趨勢,硫酸銨飽和度在0～30%之間酶活降低較慢,但蛋白質含量下降幅度較大,說明目標酶基本上還留在上清液中,沉淀中主要為其他雜蛋白;當硫酸銨飽和度達到70%時，上清液中的酶活力基本不再減少,趨于平緩,說明大部分酶已經被沉淀,綜合酶活與酶回收率兩方面考慮,確定收集30%～70%的沉淀。收集沉淀之后用少量緩沖液復溶,透析之后獲得了純化倍數為1.50倍的粗酶制劑。

圖1 硫酸銨分級沉淀Fig.1 Ammonium sulfate fractionation

2.1.2 Sephadex G-100凝膠層析 經硫酸銨沉淀之后的酶液上樣于Sephadex G-100凝膠層析,根據分子量大小的差異,洗脫出3個蛋白質峰和3個酶活力峰(圖2),其中酶活力峰p1和p3的比活力都較高,但p3蛋白含量較低,p1與p2未完全分開,考慮到三個峰的重疊情況和保證酶的回收率,收集14～25管進行后續純化,酶經此步驟獲得了比活力7.65 U·mg-1,純化倍數為2.77倍的酶制劑。

圖2 Sephadex G-100凝膠層析洗脫圖譜Fig.2 Sephadex G-100 chromatography

2.1.3 苯基疏水層析 上一步收集的酶活力峰冷凍濃縮后，上樣于苯基疏水層析柱進一步純化,根據蛋白質疏水性的差異,在洗脫過程中共出現了3個蛋白峰(圖3),其中p1為一開始用含1 mol/L硫酸銨的緩沖液洗脫出的部分未吸附上柱的雜蛋白,通過逐步降低硫酸銨濃度洗脫出2個蛋白質峰(p2、p3),均檢測出了酶活,p2的酶比活力最高,因此收集p2進行后續純化,此時洗脫液中硫酸銨濃度約為0.5 mol/L左右。此步的純化倍數為10.54,比上一步提純近4倍。

圖3 苯基疏水層析洗脫圖譜Fig.3 Phenyl Sefinose 6 Fast Flow chromatography

2.1.4 DEAE-32陰離子層析 苯基疏水層析所得酶液經透析除鹽,濃縮后上樣于DEAE-32陰離子層析柱。根據蛋白質所帶電荷的不同,共洗脫出3個蛋白峰(圖4)。當離子強度約為0.2 mol/L時活性部分被洗脫下來。此步提純1.5倍多,回收率為22%。

圖4 DEAE-32陰離子層析洗脫圖譜Fig.4 DEAE-32 Sepharose Fast Flow chromatography

從表1可以看出,本研究對從克氏原螯蝦殼膜中粗提出的幾丁質酶進行了4步純化:硫酸銨分級沉淀、G-100凝膠層析、苯基疏水層析、DEAE陰離子層析,最終幾丁質酶的比活達44.93 U/mg,純化倍數約16.28倍,酶回收率為2.98%。其中G-100凝膠層析的純化倍數較低,可能是為了保證酶回收率而選擇的酶活力峰區間較寬造成的。苯基疏水層析的純化效果較高,說明幾丁質酶與其他雜蛋白的疏水差異較大。Michiko KONO等[14]對日本對蝦肝臟幾丁質酶進行了鹽析和2次Sephadex G-100凝膠層析、2次DEAE離子交換層析、1次CM離子交換層析、1次羥磷灰石離子層析,雖然得到了純化了61.3倍、回收率為20.9%的高純度幾丁質酶,但操作步驟過于繁瑣，不適于放大生產。程明哲等[15]對中國對蝦蝦頭采用了無機沉淀和一次精制幾丁質親和層析，得到了純化倍數達108倍的幾丁質酶制劑。親和層析是分離蛋白質的一種極為有效的方法,根據載體與被分離物質之間高度的親和力而進行分離,通常只需經過一步即可使樣品從復雜的蛋白質混合物中分離出來,但載體交昂貴,配基制備困難,有的配基本身要經過分離純化,且實驗條件不同也會造成純化結果不同。李奕雅[10]通過Affi-Gel blue親和層析、CM-Sephadex C-50弱陽離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析三種分離技術,從花生中分離純化出一種抗菌幾丁質酶,純化倍數為46倍,回收率只有0.009%。造成本實驗酶回收率較低的原因可能是，粗酶液中的部分雜蛋白和幾丁質酶有相似的酶切作用,都可以產生N-NAG,使得粗酶液總活力很高,而經過3步純化后,酶液中已不含有其他雜蛋白,總活力降低,導致回收率不高。另外蛋白質經過柱層析會被緩沖液稀釋,可通過冷凍濃縮富集之后再上樣,但缺點是比較耗時耗原料,應盡可能在短時間的實驗周期內多次將樣品富集以提高純化倍數和回收率。

表1 克氏原螯蝦殼膜幾丁質酶的純化結果Table 1 Purification of chitinase from shellfish of Procambarus clarkii

2.2 分子質量和純度

SDS-PAGE顯示經過DEAE收集的活性部分只含有1條蛋白帶,說明幾丁質酶已經達到電泳純度,純化步驟完成,所得幾丁質酶無亞基,為單體結構(圖5)。以標準蛋白質的相對遷移率為橫坐標,以標準蛋白質的分子量的對數值為縱坐標,繪制標準曲線,直線的方程為y=-1.38x+2.30。根據樣品的遷移率,可求得幾丁質酶分子量約為36.8 kDa(圖6),與飛行質譜檢測出的酶分子量37.7 kDa(圖7)相近。

圖5 克氏原螯蝦幾丁質酶純化過程電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of chitinase from Procambarus clarkia注:M:標準蛋白;1:粗酶液;2:30%～70%硫酸銨沉淀后酶液;3:G-100凝膠層析后酶活力峰;4:苯基疏水層析后酶活力峰;5:DEAE-陰離子層析后酶活力峰。

圖6 SDS-PAGE蛋白相對分子量對數與電泳相對遷移率關系圖Fig.6 Relation curve of lgMr and SDS-PAGE relative front

圖7 飛行質譜測定幾丁質酶分子量Fig.7 Determination of chitinase molecular weight by flight mass spectrometry

通常幾丁質酶相對分子質量在20～120 kDa之間,不同來源的幾丁質酶相對分子量差異較大,已報道的蝦、蟹等甲殼類動物一般在30～70 kDa之間,本實驗結果與羅氏沼蝦[16]肝胰腺中提取到的幾丁質酶(38 kDa)和日本對蝦[14]肝臟中分離出的幾丁質酶(37 kDa)分子質量相當;但低于凡納濱對蝦[17]消化腺中的幾丁質酶(50 kDa),中國對蝦[15]蝦頭幾丁質酶(44.7kDa)以及脊尾白蝦[18]肝胰腺中的兩種幾丁質酶(65、44 kDa);高于豐年蟲[19]的幾丁質酶(32 kDa);Lynn[20]在和克氏原螯蝦同屬十足目的美洲螯龍蝦胃液內提取出三種分子量都為66 kDa的幾丁質酶,說明幾丁質酶分子質量大小會因種族、部位及其生活環境差異而各不相同。陳欣穎[21]從克氏原螯蝦內臟中分離出一種N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶,測得該酶含有79.9、38.8 kDa兩條亞基,全酶分子量為118.66 kDa,幾乎是本實驗結果測出的幾丁質酶分子量的3倍,由此可見雖然同屬于一個物種的幾丁質酶系,但不同的酶之間差距也非常大。

3 結論

本實驗以克氏原螯蝦殼膜為提取材料,經過勻漿抽提得到粗酶制劑,進一步通過硫酸銨沉淀、G-100凝膠層析、苯基疏水層析、DEAE-32離子層析幾種不同的分離方法純化出了比活力為44.93 U/mg,純化倍數約16.28倍,酶回收率為2.98%的幾丁質酶,SDS-PAGE顯示只有一條蛋白帶,表明幾丁質酶已達到電泳純,該酶為單體結構,不含亞基,結合飛行質譜測定出該幾丁質酶為37.7 kDa。存在的問題是回收率不高,純化步驟略繁瑣,但可為以后純化步驟提供有利條件,今后可考慮采用親和層析等其他方法進行比較及改善,對純化路線的優化有利于酶活的保持和幾丁質酶純度的提高。在酶分離純化的過程中發現G-100凝膠層析出現了三個酶活力峰,并且苯基疏水層析分離出有較弱的幾丁質酶活性的酶活力峰,說明可能有同工酶的存在,有待于進一步的純化。酶的分離純化過程是對其接下來各種性質等研究的分子基礎,為進一步探討酶的結構與功能、酶活性調控與克氏原螯蝦生長發育、疾病及環境因素之間的相關性奠定重要的研究基礎。