響應(yīng)面法優(yōu)化薏米中結(jié)合型多酚的提取工藝

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(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122; 2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇南京 210023)

薏米(Coixlacryma-jobi),屬于禾本科薏米屬草本植物,主要分布在亞洲熱帶太平洋島嶼附近,中國(guó)、印度、越南、緬甸、巴西、日本等許多國(guó)家都有種植[1]。薏米是一種藥食兩相宜的農(nóng)作物,作為藥,薏米可入脾肺,有利于清熱排膿。作為食品,薏米營(yíng)養(yǎng)豐富,薏米中含有豐富的膳食纖維、維生素、脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)及礦物質(zhì);其中含油脂類(lèi)占7.2%。薏米中含有8種人體必需氨基酸,薏米仁中支鏈氨基酸含量為17.5%,抗氧化作用的氨基酸占10.8%[2]。并且氨基酸的比例與人體需要的比例十分接近,比其他全谷物食品更易被人體吸收,薏米也被譽(yù)為“世界禾本科植物之王”。

薏米可以分為薏米殼、薏米麩皮、薏米仁。薏米殼中含有豐富的膳食纖維及α-生育酚[3],Kuo等[4]鑒定出薏米殼中含有丁香酸、木酚素、4-酮松脂酚、松柏醇、阿魏酸、丁香脂素6種抗氧化物質(zhì),除此以外,還含有圣草素、神經(jīng)酰胺、對(duì)-香豆素[5]。薏米麩皮中含有內(nèi)酰胺類(lèi)化合物、黃烷酮類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、多酚類(lèi)化合物、木質(zhì)素等[1,6-7],其對(duì)癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗增殖作用并且具有免疫反應(yīng)的調(diào)制作用[8]。阿魏酸是薏米麩皮中的主要酚類(lèi)化合物,并且該物質(zhì)可以抑制結(jié)腸腫瘤的癌變以及阻止心肌抑制因子(MDF)的形成[9]。

薏米仁中含有豐富的脂肪酸、多酚類(lèi)、甾醇類(lèi)化合物等物質(zhì),研究發(fā)現(xiàn)薏米經(jīng)脫脂后的丙酮提取物具有明顯的抗腫瘤、抗氧化、降血脂的作用[10]。有學(xué)者另將薏米中游離型多酚經(jīng)過(guò)葡聚糖LH-20凝膠及半制備液相分離純化后,得到四種薏米多酚純化物,分別為N1,N5-雙(對(duì)香豆酰)亞精胺、阿魏酸、蘆丁和對(duì)香豆酸,后證實(shí)其具有很強(qiáng)的抗氧化活性[11]和抗腫瘤活性[12]。但是,薏米中另一類(lèi)多酚,結(jié)合型多酚的活性物質(zhì)的研究很少,而且與游離型多酚相比，提取方法較為復(fù)雜,導(dǎo)致其在谷物中的作用經(jīng)常被忽視,之前有研究表明橙皮中結(jié)合型多酚比游離態(tài)多酚的抗氧化能力更好。

因此,本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，采用有機(jī)溶劑結(jié)合NaOH消化法提取薏米中的結(jié)合型多酚,有機(jī)溶劑可以使多酚與蛋白質(zhì)或多糖之間形成的氫鍵斷裂,NaOH的加入可有效的破壞細(xì)胞壁,使結(jié)合型多酚更利于提取。通過(guò)福林-酚比色法,在不同條件下測(cè)定所提薏米結(jié)合型多酚的含量,并運(yùn)用Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)分析薏米結(jié)合型多酚的最優(yōu)提取條件,為后續(xù)對(duì)薏米中結(jié)合型多酚的相關(guān)性質(zhì)及功能的進(jìn)一步研究提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薏米 品種為貴州小薏米,貴州黔西南農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);石油醚、福林酚、碳酸鈉(Na2CO3) 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;沒(méi)食子酸 色譜純,美國(guó)Sigma公司。

FW100型高速粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;TP-214型電子分析天平 丹佛儀器北京有限公司;THZ-D型臺(tái)式恒溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;pHS-3C型型精密數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠;Beckman Coulter J6型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司;SpectraMax M2型酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;ALpHA2-4型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮化學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薏米結(jié)合型多酚的提取工藝 根據(jù)文獻(xiàn)[10-12]方法稍作修改,薏米經(jīng)高速粉碎機(jī)得到薏米粉末,過(guò)60目篩,混入石油醚震蕩脫脂,反復(fù)3次,烘干,保存于-20 ℃冰箱。脫脂薏米粉末先使用丙酮萃取出游離多酚,剩余薏米殘?jiān)捎肗aOH消化法。首先將殘?jiān)cNaOH溶液混勻,震蕩進(jìn)行消化處理,加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為2,加入乙酸乙酯以一定溫度浸提20 min后，于冷凍離心機(jī)3500 r/min離心10 min，所得上清液即結(jié)合型多酚,重復(fù)5次,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干,溶于去離子水,并置于冷凍干燥機(jī)凍干至粉末狀,保存于-20 ℃,即薏米結(jié)合型多酚粗品。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 NaOH消化濃度對(duì)結(jié)合型多酚提取的影響 取10 g薏米殘?jiān)?用20 mL 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mol/L不同濃度NaOH溶液20 mL消化處理后,于室溫下震蕩消化4 h,按料液比1∶3 (m/v)加入乙酸乙酯在30 ℃下浸提20 min后,于冷凍離心機(jī)3500 r/min離心10 min,得上清液,重復(fù)5次,最后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去有機(jī)溶劑,溶于去離子水,冷凍干燥至白色粉末,研究NaOH消化濃度對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取的影響。

1.2.2.2 消化時(shí)間對(duì)結(jié)合型多酚提取的影響 取10 g薏米殘?jiān)?用20 mL 2.5 mol/L NaOH溶液消化后,震蕩消化2、3、4、5、6 h,按料液比1∶3 (m/v)加入乙酸乙酯在30 ℃下浸提20 min后,于冷凍離心機(jī)3500 r/min離心10 min,得上清液,重復(fù)5次,最后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去有機(jī)溶劑,溶于去離子水,冷凍干燥至白色粉末,研究堿消化時(shí)間對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取的影響。

1.2.2.3 乙酸乙酯浸提溫度結(jié)合型多酚提取的影響 取10 g薏米殘?jiān)?用20 mL 2.5 mol/L NaOH溶液消化后,于室溫下震蕩4 h,按料液比1∶3 (m/v)加入乙酸乙酯在20、30、40、50、60 ℃下浸提20 min后,于冷凍離心機(jī)3500 r/min離心10 min,得上清液,重復(fù)5次,最后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去有機(jī)溶劑,溶于去離子水,冷凍干燥至白色粉末,研究乙酸乙酯浸提時(shí)間對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取的影響。

1.2.3 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素實(shí)驗(yàn)為參考,采用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選取NaOH消化濃度、消化時(shí)間以及乙酸乙酯浸提溫度3個(gè)因素,分別以A、B、C為代表,每一個(gè)自變量的低中高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼,采用3因素3水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化薏米中結(jié)合多酚的提取工藝。響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1[13-15]。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 1 Variables and levels of response surface design

1.2.4 薏米結(jié)合型多酚含量的測(cè)定 薏米結(jié)合型多酚總酚含量測(cè)定選用Singleton所描述的福林-酚比色法[16],并根據(jù)文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行改動(dòng)。具體步驟如下:經(jīng)葡聚糖凝膠分離后的所有組分凍干成粉末后,取一定量溶于去離子水中，以0.0～600.0 μg/mL濃度的沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液并以此作標(biāo)準(zhǔn)曲線,多酚混合物與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)后，加入碳酸鈉終止該反應(yīng)，并在室溫下靜置90 min后，于760 nm吸光度下用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定,總酚提取得率公式為:

式中，C:總酚濃度(μg沒(méi)食子酸/mL);V:測(cè)量液體積(mL);N為稀釋倍數(shù);W為原料重量(100 g)。提取得率表示為每100 g薏米粉末mg沒(méi)食子酸等量。每個(gè)樣品至少重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,單因素實(shí)驗(yàn)采用SPSS version 17.0和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 NaOH消化濃度對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取得率的影響 由圖1可知,在該條件下,薏米結(jié)合型多酚的提取得率隨著NaOH消化濃度的升高而增大,當(dāng)NaOH濃度增大到2.5 mol/L時(shí),提取得率最大,并且當(dāng)濃度大于2.5 mol/L后,其提取得率基本穩(wěn)定在24～25 mg/100 g左右,在NaOH濃度為2.5 mol/L時(shí),薏米中的結(jié)合型多酚釋放的較為完全。并且考慮到之后所用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH時(shí)的用量,適宜選取的NaOH濃度在2.5 mol/L,提取得率為(24.95±0.78) mgGAE/100 g。

圖1 消化濃度對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取得率的影響Fig.1 Effect of degrading concentrations on extraction rate of bond polyphenols in adlay

2.1.2 NaOH消化時(shí)間對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取得率的影響 由圖2可知,在該條件下,薏米結(jié)合型多酚的提取得率隨著NaOH消化時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,于4 h時(shí)達(dá)到最高值,當(dāng)消化時(shí)間不足4 h時(shí),薏米結(jié)合型多酚提取得率的增長(zhǎng)趨勢(shì)較大,而當(dāng)消化時(shí)間超過(guò)4 h,提取得率基本保持穩(wěn)定,甚至有略微下降,但趨勢(shì)并不明顯。這可能是由于NaOH處理過(guò)程中,在4 h左右細(xì)胞壁才能破碎完全,結(jié)合型多酚的提取得率也在此時(shí)達(dá)到最大。消化時(shí)間4 h時(shí)薏米結(jié)合型多酚提取為(24.95±0.78) mgGAE/100 g。

圖2 消化時(shí)間對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取得率的影響Fig.2 Effect of degrading time on extraction rate of bond polyphenols in adlay

2.1.3 浸提溫度對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取得率的影響 由圖3可知,選取乙酸乙酯提取薏米結(jié)合型多酚時(shí),浸提溫度對(duì)提取得率的影響較大。當(dāng)浸提溫度為50 ℃時(shí),提取得率為最高,為(29.28±1.65) mgGAE/100 g。當(dāng)浸提溫度小于50 ℃時(shí),提取得率隨著浸提溫度的升高而上升,當(dāng)浸提溫度為60 ℃時(shí),提取得率下降,這是因?yàn)殡S著溫度的上升,薏米結(jié)合型多酚溶解度增加,但溫度過(guò)高時(shí),薏米結(jié)合型多酚易被破壞[18]。因此,響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中薏米結(jié)合多酚浸提溫度不易超過(guò)60 ℃。

圖3 浸提溫度對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取得率的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on extraction rate of bond polyphenols in adlay

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken模型,采用NaOH消化濃度、消化時(shí)間、乙酸乙酯浸提溫度進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),分析提取薏米中結(jié)合型多酚的最佳工藝條件。得到的試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results of optimizing test with response surface method

Y=27.67+2.09A+1.38B+2.57C+0.18AB-0.72AC+0.080BC-2.21A2-2.36B2-1.76C2

對(duì)該模型的方差分析見(jiàn)表3,方程決定系數(shù)為0.9814,說(shuō)明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間相關(guān)性較高,模型對(duì)實(shí)驗(yàn)有較好的擬合性;同時(shí)模型p<0.05,顯著,失擬項(xiàng)p值為0.9790>0.05,不顯著,表明所建立的二次回歸模型能有效的對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。方程一次項(xiàng)A、B、C對(duì)Y值的影響顯著(p<0.05),交互作用對(duì)Y值影響不顯著,二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)Y值的影響顯著(p<0.05)。由3個(gè)獨(dú)立變量的F值可知,C>A>B,即對(duì)薏米結(jié)合多酚提取得率影響因素的主次順序?yàn)橐宜嵋阴ソ釡囟?NaOH消化濃度>NaOH消化時(shí)間。

表3 提取得率回歸分析結(jié)果Table 3 Regression analysis results of extracting rate

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 圖4為由回歸方程所作的等高線及相應(yīng)曲面。該圖直觀顯示了當(dāng)NaOH消化濃度、消化時(shí)間及乙酸乙酯浸提溫度3個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取得率的影響。根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面和等高線結(jié)果見(jiàn)圖4。在響應(yīng)面圖中,曲面越陡峭,等高線越密集,則兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著,其曲線越接近中心,則對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值也就越大[19]。從圖4可以看出,NaOH消化濃度(A)與消化時(shí)間(B)、NaOH消化濃度(A)與乙酸乙酯浸提溫度(C)以及消化時(shí)間(B)與乙酸乙酯浸提溫度(C)3組交互作用的等高線分化不密集,接近圓形,因此,交互作用AB、AC、BC對(duì)薏米結(jié)合型多酚提取得率無(wú)顯著影響。

圖4 兩因素交互作用對(duì)總酚提取得率影響的響應(yīng)曲面圖(左)及等高線圖(右)Fig.4 Response surface(left)and counter(right)plots of two variables on extraction rate of total polyphenols

2.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)所建立的模型通過(guò)軟件進(jìn)行最優(yōu)分析,在條件為:NaOH濃度為3.26 mol/L,消化時(shí)間為4.63 h,溫度為53.18 ℃時(shí)可得到薏米結(jié)合型多酚最高提取得率,為29.3237 mgGAE/100。為了實(shí)際操作方便,將上述條件簡(jiǎn)化為NaOH濃度為3.26 mol/L,消化時(shí)間為4.6 h,溫度為53 ℃,實(shí)測(cè)薏米結(jié)合型多酚提取得率為(30.16±1.08) mgGAE/100 g,誤差率為2.83%,因此確定上述模型可靠具有參考性。

3 結(jié)論

提取薏米結(jié)合型多酚的最優(yōu)條件為NaOH濃度為3.26 mol/L,消化時(shí)間為4.6 h,溫度為53 ℃。此條件下得到模型中結(jié)合型多酚的提取得率預(yù)測(cè)值為29.3237 mgGAE/10,實(shí)測(cè)結(jié)果為(30.16±1.08) mgGAE/100 g,說(shuō)明該方法得到的薏米結(jié)合型多酚提取條件真實(shí)可靠,并具有較高的提取得率。因此,利用NaOH消化結(jié)合乙酸乙酯浸提是一種有效提取薏米中結(jié)合多酚的方法,對(duì)植物多酚的開(kāi)發(fā)與利用具有一定的指導(dǎo)意義。