響應面法優化水酶法提取番木瓜籽蛋白質工藝

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(嶺南師范學院化學化工學院,廣東湛江 524048)

番木瓜(CaricapapayaL.),屬番木瓜科,番木瓜屬,又名木瓜、萬壽果等。番木瓜屬藥食兼用水果,含有糖類、木瓜蛋白酶、黃酮類、類胡蘿卜素、多酚類、萜烯類和生物堿等多種營養成分和植物化學物質,具有抗腫瘤、增強免疫調節和抗癌等作用[1-4]。產自熱帶和亞熱帶地區,在我國主要在廣東、海南、廣西等地區種植。因其豐富的營養價值和醫療價值,消費者對于其需求有增無減[5]。番木瓜除可以鮮食外,還可加工成果醬和果汁等[6-8]。番木瓜籽是番木瓜鮮食或加工成相關產品后的副產物,通常將其作為廢棄物丟掉,不僅造成環境污染,而且浪費資源。目前,有關番木瓜籽的活性成分如硫代葡萄糖苷[9]、異硫氰酸酯類物質[10]、多酚[11]等都有相關報道,番木瓜籽粗提取也有很多功能特性,如抗氧化活性等[12-13],番木瓜籽中油脂的研究也有很多文獻報道[14-19]。

植物蛋白質的提取目前主要為堿溶酸沉法,反膠束萃取技術在植物蛋白質的提取中也有相關的報道[20]。王標詩等[21]報道了堿溶酸沉法提取番木瓜籽中蛋白質并對其功能性質進行了探討;馬若影等[22]也研究了番木瓜籽蛋白質超聲輔助提取以及超聲協同微波輔助提取工藝及其性質進行了研究;Parniakov等[23]報道了脈沖電能輔助水提取番木瓜籽中蛋白質、多酚及碳水化合物等研究,但是通過這些研究發現番木瓜籽蛋白質的提取率相對還不是很高,提取過程中也不能回收其他成分。目前,水酶法已在多種植物種籽中都得到了應用,水酶法在提取蛋白質的同時可以有效的回收油料中其他營養物質[24],如油脂等,具有廣闊的市場前景。番木瓜籽中還含有一定量的蛋白質,可作為植物蛋白質的良好來源,但是目前對于番木瓜籽中的蛋白質的研究鮮有報道。有關水酶法提取番木瓜籽蛋白質還未見報道。

為此,本論文以番木瓜籽為研究對象,通過響應面法優化了水酶法提取番木瓜籽中蛋白質的工藝條件,以期為番木瓜的綜合開發高值化利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番木瓜(九成熟) 購于當地水果市場,產地為湛江;中性蛋白酶(20萬U/g,pH7.0～7.8,40 ℃) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;堿性蛋白酶(20萬U/g,pH8.5～10.5,50～60 ℃) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;木瓜蛋白酶(20萬U/g,pH6.0～7.0,55～65 ℃) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;纖維素酶(20萬U/g,pH4～5.5,50～60 ℃) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;其他化學試劑 均為分析純。

DFY-800搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;KDN-103F自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;HC-3518高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;BCD-256KFA冰箱 青島海爾股份有限公司;FA1004N電子天平 上海精密科學儀器有限公司;pHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠;HYP-1004消化爐 上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 番木瓜切開取籽,經清洗干凈后在60 ℃恒溫干燥箱中干燥約10 h,用粉碎機粉碎并60目過篩,備用。

1.2.2 水酶法提取番木瓜籽蛋白質 稱取一定量的番木瓜籽于干凈的燒杯中,按照一定的料液比加入水,按一定的加酶量加入某種酶,在一定的溫度、一定的pH下水解一段時間,水解后于90 ℃條件下處理10 min進行滅酶,然后在4000 r/min離心30 min,濾渣用清水清洗后再在4000 r/min的離心機下常溫離心30 min,合并濾液和清洗液,去掉上層油脂層后得到酶解液,用于蛋白質提取率的測定。

1.2.3 酶種類的選擇 稱取一定量的番木瓜籽粉到干凈燒杯中,按料液比1∶15 (g/mL)加水,分別添加中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶,按1.5%的加酶量在各種酶的最適溫度和pH條件下(中性蛋白酶pH7.5,40 ℃;堿性蛋白酶pH9.5,55 ℃;木瓜蛋白酶pH6.5,60 ℃;纖維素酶pH5.0,55 ℃)酶解3 h,90 ℃條件下處理10 min進行滅酶,然后在4000 r/min常溫離心30 min,測定酶解液蛋白質含量。空白試驗：自然pH和常溫下，不加蛋白酶處理，其他相同。以蛋白質提取率為指標評價各種酶的提取效果。

1.2.4 單因素實驗 在篩選出最佳酶的基礎上,按照1.2.2的方法,以蛋白質提取率為指標,在pH為7.5,40 ℃下,以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶酶解3 h,探討不同料液比(1∶11、1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21)對番木瓜籽蛋白質提取率的影響;以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶,在pH為7.5下,酶解3 h,探討不同溫度(30、35、40、45、50、55、60 ℃)對番木瓜籽蛋白質提取率的影響;在pH為7.5、40 ℃下,酶解3 h,探討木瓜蛋白酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)對番木瓜籽蛋白質提取率的影響;以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶,在pH為7.5、40 ℃下進行酶解,探討酶解時間(2、3、4、5、6 h)對番木瓜籽蛋白質提取率的影響;以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶,在40 ℃下酶解3 h,探討不同pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)對番木瓜籽蛋白質提取率的影響。

1.2.5 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上,采用Box-Behnken試驗設計優化木瓜蛋白酶在料液比為1∶19下提取番木瓜籽蛋白質的工藝參數。以pH、酶添加量、溫度、時間為影響因素,以蛋白質提取率為試驗指標,響應面試驗設計因素與水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.6 蛋白質提取率的測定 蛋白質測定方法為凱氏定氮法,參考GB 5009.5-2010。

蛋白質提取率(%)=酶解液中蛋白質的含量(g)/樣品質量(g)×樣品中粗蛋白的含量(%)×100

1.3 數據分析

以上實驗均重復測量3次,實驗結果以平均值±標準偏差的形式表示,數據之間的顯著性差異采用SPSS軟件進行分析。響應面法采用Design Expert軟件中的Box-Behnken進行設計,數據分析采用Design Expert軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 樣品中蛋白質含量的測定結果

經凱氏定氮法分析測定可知,番木瓜籽中的粗蛋白質含量為26.21%±0.15%。據文獻報道,鄧楚津等[25]研究結果表明番木瓜籽中粗蛋白質的含量為24.91%,Marfo等[26]研究結果表明番木瓜籽中蛋白質含量為27.8%,Briones-Labarca等[27]研究結果表明番木瓜籽(樣品濕度為3.5%時)中蛋白質含量為31.84%±0.03%,去除水分約為28.34%,這些結果均在24%～29%,本試驗的結果在此范圍內,產生的差別的原因可能由于番木瓜來源、品種和成熟度等不同所致。

2.2 酶的選擇

各種酶對蛋白質提取率影響結果如圖1所示。水酶法提取過程中酶的選擇至關重要。從圖1可看出,在各種酶的最適條件下添加木瓜蛋白酶時,蛋白質的提取率高于其他酶,而添加中性蛋白酶與堿性蛋白酶時,蛋白質的提取率非常接近,沒有顯著性差異(p<0.05),他們與木瓜蛋白酶和纖維素酶之間差異顯著(p<0.05)。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶的最適pH均遠離番木瓜籽蛋白的等電點(約3.3),不同程度上提高了蛋白質在體系中的溶解度,從而易于蛋白酶的作用[24],相對而言，木瓜蛋白酶效果更好。而纖維素酶只對細胞壁具有破壞作用,酶不能完全接觸到蛋白質等物質,提取率較低,由于木瓜蛋白酶也是常用的水解酶之一,因此選擇木瓜蛋白酶作為最佳用酶。

圖1 酶的種類對番木瓜籽蛋白質提取的影響Fig.1 Effects of different enzymes on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3 單因素實驗

2.3.1 料液比對番木瓜蛋白質提取率的影響 料液比對蛋白質提取率的影響結果如圖2所示。由圖2可知,總體上隨著料液比的增大,番木瓜蛋白質的提取率不斷增大;當料液比在1∶11～1∶15時,番木瓜蛋白質提取率增加較快;料液比低于1∶15時,提取率相對較小,這是因為料液比低時,體系中水量有限,可以溶解的蛋白質量也有限[24];之后隨著料液比的增加提取率增加相對較為緩慢,達到1∶19后基本上不增加,可能由于溶劑過多,對蛋白質有一定的稀釋作用,故選擇以1∶19做為最佳料液比。

圖2 料液比對番木瓜籽蛋白質提取率的影響Fig.2 Effects of material/solvent ratio on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.2 溫度對番木瓜籽蛋白質提取率的影響 溫度對蛋白質提取率的影響結果如圖3所示。由圖3可知,在30～50 ℃時,隨著溫度的提高,番木瓜蛋白質的提取率增大;當溫度達到50 ℃時,提取率達到最大值80.63%;當溫度超過50 ℃后,提取率隨著溫度的提升而下降,這是由于木瓜蛋白酶在超過50 ℃時使其偏離其最適溫度,導致提取率降低。因此選擇50 ℃作為酶解溫度。

圖3 溫度對番木瓜籽蛋白質提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.3 酶添加量對番木瓜籽蛋白質提取率的影響 酶添加量對蛋白質提取率的影響結果如圖4所示。由圖4可知,在酶添加量為1.5%～2.0%之間時,提取率增大速度最快,提取率最大為84.70%,當用酶量超過2.0%時,提取率開始緩慢下降,進一步增加酶用量,提取率不會提高,這可能是因為蛋白質受到酶的過度水解,空間結構受到破壞[28]。再者,考慮到酶的價格較高,酶用量過高加大產品的成本,因此選擇最佳加酶量為2.0%。

圖4 酶添加量對番木瓜籽蛋白質提取的影響Fig.4 Effects of enzyme amount on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.4 酶解時間對番木瓜籽蛋白質提取率的影響 酶解時間對蛋白質提取率的影響結果如圖5所示。由圖5可知,在提取時間為2～3 h時,蛋白質提取率增加較快,之后3～4 h時增加過緩,4 h后增加非常緩慢,到5 h達到最大值83.38%,之后反而略有降低,這是因為底物隨酶解時間的延長而不斷減少,酶解產物會對酶解反應起到一定的抑制作用[29]。綜合考慮后,選擇5 h為最佳酶解時間。

圖5 酶解時間對番木瓜籽蛋白質提取的影響Fig.5 Effects of time on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.5 酶解pH對番木瓜籽蛋白質提取率的影響 酶解pH對蛋白質提取率影響結果如圖6所示。由圖6可知,pH從6.5增加到7.0,蛋白質提取率也隨之增大,當pH為7時,有最大值84.71%,當pH從7.0增加到8.0時,提取率明顯降低,這是由于在pH為7時接近于此條件下的最適pH,此時酶活性最高,酶解蛋白的能力也最強,因此選擇最佳pH為7。

圖6 pH對番木瓜籽蛋白質提取率影響Fig.6 Effects of pH on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.4 響應面分析法優化水酶法提取番木瓜籽蛋白質的工藝

2.4.1 響應面試驗結果與分析 在單因素試驗的基礎上,以pH、加酶量、溫度、時間為影響因素變量,以蛋白質提取率為試驗指標,通過Box-Behnken試驗設計方案按表1進行四因素三水平設計試驗,結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and resultsfor response surface analysis

對表2的數據在Design Expert上進行分析得到擬合方程如下:

由Design Expert軟件進行回歸及方差分析結果如表3所示。對數學模型進行方差分析,結果表明模型的總回歸也極顯著(p<0.01),其決定系數R2為0.9975,這說明該模型在試驗范圍內擬合度較高。二次回歸方程可用于對試驗進行可靠分析和預測[29]。對數學模型進行失擬檢驗,顯示其失擬性呈不顯著(p>0.05),說明該模型在試驗范圍內擬合度也是比較高的。對該數學模型的回歸系數檢驗可知:四個因素對試驗的影響極顯著(p<0.01),而交互項中的交互影響均為極顯著(p<0.01)。通過F值的大小判斷可得各個因素對番木瓜籽蛋白質提取率的影響力為X3>X4>X2>X1,即溫度>酶解時間>pH>酶添加量。

表3 Design Expert軟件回歸模型和方差分析結果Table 3 Results of regression and variance analysis by Design Expert software

2.4.2 響應面分析與最優條件的確定 三維響應面和等高線圖是回歸方程的圖形表現形式,可用來表示測試變量和響應值與各變量水平之間的相互作用關系。通過圖7～圖12中6組響應面及等高線的形狀來分析酶添加量、酶解pH、酶解溫度和酶解時間4個主要因素間的交互作用對番木瓜籽蛋白質提取率的影響,結果發現,響應面圖呈現先升高后降低的趨勢,酶添加量和pH(X1X2)、酶添加量和溫度(X1X3)交互作用較其它交互作用更強,這與方差分析結果基本一致。

從圖7～圖12可看出,三維圖總體趨勢為向上凸起,說明該數學模型具有最大值。利用Design-Expert軟件對試驗數據進一步分析,并對擬合的回歸方程進行計算,預測水酶法提取番木瓜籽蛋白質的最佳工藝條件當X1=2.04,X2=6.97,X3=49.22,X4=5.38時,即酶添加量為2.04%,pH為6.97,溫度為49.22 ℃,酶解時間為5.38 h時,理論提取率最大為85.03%。由于實驗條件限制,將該條件修訂為酶添加量為2.0%,pH為7.0,溫度為49 ℃,酶解時間為5.0 h時,對該條件進行驗證試驗,實際測得的結果為84.96%±0.13%,軟件在該點的估計值為84.94%,與預測值相比,誤差僅為0.08%,接近預測值,表明在該試驗模型下得到的最佳工藝條件具有較高的可靠性,可以用于預測水酶法提取番木瓜籽蛋白質的工藝條件。

圖7 酶添加量和pH對蛋白質提取率的影響響應面和等高值圖Fig.7 Response surface and contour of effect of enzymes amount and pH on the extraction rate of protein from papaya seed

圖8 溫度和酶添加量對蛋白質提取率的影響響應面和等高值圖Fig.8 Response surface and contour of effect of enzymes amount and temperature on the extraction rate of protein from the papaya seed

圖9 時間和酶添加量對蛋白質提取率的影響響應面和等高值圖Fig.9 Response surface and contour of effect of enzymes amount and extraction time on the extraction rate of protein from the papaya seed

圖10 溫度和pH對蛋白質提取率的影響響應面和等高值圖Fig.10 Response surface and contour of effect of temperature and pH on the extraction rate of protein from the papaya seed

圖11 時間和pH對蛋白質提取率的影響響應面和等高值圖Fig.11 Response surface and contour of effect of time and pH on the extraction rate of protein from the papaya seed

圖12 溫度和時間對蛋白質提取率的影響響應面和等高值圖Fig.12 Response surface and contour of effect of time and temperature on the extraction rate of protein from the papaya seed

3 結論

本試驗在單因素試驗基礎上,利用響應面分析法優化了水酶法提取番木瓜籽蛋白質的工藝條件。最終得出最佳工藝條件為:使用木瓜蛋白酶在料液比為1∶19,酶添加量為2.0%,pH為7.0,溫度為49 ℃,酶解時間為5 h,此時番木瓜籽蛋白質的提取率最高為84.96%±0.13%。四個因素對番木瓜籽蛋白質提取率的影響為溫度>酶解時間>pH>酶添加量。對番木瓜籽的高值化綜合開發利用,不僅有利于解決廢棄物造成的環境污染問題,還將帶來良好的經濟效益和社會效益。