黑果枸杞總黃酮固體分散體的制備

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(新疆醫科大學藥學院,新疆烏魯木齊 830011)

黑果枸杞屬茄科、紫黑色,果實里面含豐富的紫紅色素,極易溶于水,屬天然的水溶性花色甙黃酮類[1-2]。它生長在人類無法生存的荒山野嶺、河床沙灘,擁有著極強的生命力,其中黃酮類化合物又稱黃酮堿或黃酮,作為一種重要的多酚類天然產物,幾乎存在于所有有色植物中,分布廣泛,具有多種生物活性,即降血壓、降血糖、抗腫瘤、調節免疫力、抗氧化、抗菌、保護心血管等功能[3-4]。但是黃酮為難溶于水的化合物,在溶液中難以形成維持有效濃度的釋藥速度,水溶性比較差,難以被胃腸道吸收,從而導致口服生物利用度低,在醫療使用上受到限制。據報道,40%新化學實體均為水難溶性或水不溶性物質,且高達50%藥物因高疏水性而給制劑帶來困難[5-6]。隨著研究的深入,難溶性藥物的開發和利用日漸增多,在提高難溶性藥物溶出度和生物利用度等方面固體分散技術的優勢將更為凸顯。由于新載體材料和新制備方法取得長足進展,加上在緩控釋制劑領域展現出廣闊的應用前景,固體分散體必將在藥劑學領域占據重要地位。因此通過制備黃酮固體分散體,黃酮在固體分散體中,以分子、無定形、微晶等形式處于高度分散狀態,且因常采用PVPK-30等載體材料,增強了藥物的可潤濕性,因而可極大改善黃酮的溶出和吸收特性,提高其口服生物利用度[7-9]。

本實驗采用性質優良的載體材料,通過單因素和正交試驗設計篩選黑果枸杞總黃酮固體分散體的制備工藝參數,并進行物相鑒定,利用固體分散體技術改善黑果枸杞總黃酮在水中體外溶出行為,提高其生物利用度,為黑果枸杞類似產品的開發利用提供理論依據和實驗基礎,以達到保證療效目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

黑果枸杞果實 紫黑色球狀果實,采自于新疆阿克蘇地區塔里木盆地;蘆丁對照品 成都曼斯特生物科技有限公司,UV級,純度為98.6%;聚維酮K-30(PVP-K30,白色粉末)、聚維酮K-15(PVP-K15,白色粉末)、聚乙二醇4000(PEG4000,白色粉末)、聚乙二醇6000(PEG6000,白色粉末)、普朗尼克F68 德國巴斯德國巴斯夫中國有限公司上海分公司,批號20161228;石油醚(60～90 ℃)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇(分析純)。

CP225D電子天平 德國Sartorius公司;XL-02A型扣壓式小型粉碎機 旭朗機械設備有限公司;數顯恒溫雙頭磁力攪拌器 金壇市金祥龍電子公司;UV-9100型紫外可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司;RCZ-6B2藥物溶出度儀 上海黃海藥檢儀器公司;KQ3200B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司;XRD-6000 X射線衍射儀 日本島津;TGA1000熱重分析儀 上海盈諾精密儀器有限公司;SIGMA 500掃描電鏡 德國卡爾蔡司公司;FDU-2100實驗室小型-80 ℃冷凍干燥機 日本東京理化器械株式會。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑果枸杞總黃酮的制備 將采集的黑果枸杞清洗后在(105±2) ℃干燥至恒重,用粉碎機粉碎并過40目篩子,索氏提取器用石油醚脫脂6.0 h,50 ℃烘箱干燥2.0 h后備用。精密稱取脫脂后黑果枸杞粉0.5 g,在黑果枸杞粉和50%乙醇溶液按照1∶5 g/mL比例、超聲功率為70 W、超聲溫度60 ℃條件下提取15 min,在3000 r/min離心10 min。離心后的提取液在0.2 MPa,50 ℃條件下減壓濃縮,采用真空干燥箱在50 ℃條件下干燥,獲得黑果枸杞總黃酮干燥物[10-11]。

1.2.2 黑果枸杞總黃酮含量測定

1.2.2.1 檢測波長的確定 精密稱取真空干燥后黑果枸杞總黃酮10 mg置100 mL容量瓶中,加入50%乙醇溶解并稀釋至刻度。精密量取1.0 mL黃酮溶液置于100 mL容量瓶中,并按照硝酸鋁顯色法顯色[12],再用0.45 μm微孔濾膜過濾,在400～700 nm波長范圍內進行掃描,黑果枸杞總黃酮在510 nm處有最大吸收,而此處PVP-K30、PVP-K15、PEG6000、PEG4000、F68無吸收干擾,所以選擇510 nm為測定波長。

1.2.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁標準品20 mg置10 mL容量瓶中加50%乙醇稀釋至刻度,配制成2 mg/mL的標準儲備液。分別精密量取儲備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置25 mL容量瓶中,加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL,搖勻放置5 min,加10%硝酸鋁溶液1.0 mL,搖勻放置5 min,加4%氫氧化鈉溶液10 mL,加50%乙醇溶液至刻度,搖勻放置15 min,以相應的試劑溶液為空白,在510 nm處測定吸光度。以蘆丁質量濃度(C,mg/mL)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線,其回歸方程和相關系數為:C=9.493A+0.044,R=0.9993,標準曲線具有良好的擬合性。

1.2.3 固體分散體的制備

1.2.3.1 熔融法制備固體分散體 精密稱取PVP-K30、PVP-K15置于燒杯中,在65 ℃水浴加熱其熔融,加入黑果枸杞黃酮粉末,邊加邊攪拌,使黃酮完全融于載體中,繼續攪拌45 min。然后從水浴中取出,放入預冷的托盤中,在冷阱溫度-80 ℃,真空度2.0 Pa,最大加熱板溫度25 ℃條件下真空冷凍干燥28 h,得到黑果枸杞黃酮固體分散體。將干燥物從托盤中取出,研碎,過80目篩,置干燥器避光保存[13-14]。

1.2.3.2 溶劑法制備固體分散體 精密稱取PEG4000、PEG6000、F68與黑果枸杞總黃酮粉于燒杯中,加入50 mL無水乙醇溶解,置于磁力攪拌器中攪拌,直至總黃酮粉和載體均溶解成澄明液體,繼續攪拌至45 min,減壓蒸發至黏稠時,迅速倒入預冷的托盤中,其他操作同上1.2.3.1[15-16]。

1.2.3.3 物理混合物的制備 為驗證固體分散體是否形成,制備黑果枸杞總黃酮與PVP-K30、PVP-K15、PEG4000、PEG6000、F68的物理混合物。精密稱取黑果枸杞總黃酮粉末與不同載體,置研缽中研細,過80目篩,裝于自封袋內,振搖5 min,混合均勻后即得不同載體的物理混合物,封口避光保存備用。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 載體材料的選擇 以累積釋放百分率為考察指標,分別選擇PEG4000、PEG6000、PVP-K15、PVP-K30、泊洛沙姆為載體材料,原料與載體按照1∶3的比例,攪拌45 min,分別采用上述溶劑法和熔融法制備固體分散體,篩選適宜的載體材料。

1.2.4.2 原料與載體材料比例的篩選 以累積釋放百分率為考察指標,分別選擇原料與載體比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的比例,PVP-K30為載體材料,攪拌45 min,分別采用上述溶劑法和熔融法制備固體分散體,篩選適宜的原料與載體材料的比例。

1.2.4.3 攪拌時間的篩選 以累積釋放百分率為考察指標,PVP-K30為載體材料,按照1∶3比例,分別攪拌30、45、60、75、90 min,分別采用上述溶劑法和熔融法制備固體分散體,篩選適宜的攪拌時間[17-18]。

1.2.5 正交試驗 根據單因素實驗結果,以累積釋放百分率為考察指標,采用L9(34)正交實驗設計,篩選黑果枸杞總黃酮固體分散體制備工藝參數[19],正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3 指標的測定

采用《中國藥典》2015年版二部附錄“溶出度測定法”規定的轉籃法測定溶出度。溶出介質:采用鹽酸(0.1 moL/L鹽酸,含0.2%十二烷基硫酸鈉)為溶出介質,體積900 mL;溫度:(37±0.5) ℃;轉速:100 r/min。分別于0、3、6、9、12、15、30、45、60 min時取樣5 mL,0.45 μm微孔濾膜過濾,同時向溶出液中補充新鮮介質5 mL。量取續濾液,按照硝酸鋁顯色法顯色方法,在510 nm測定吸光度A,根據標準曲線計算黃酮的濃度,折算成溶出度,按照下面公式計算其累積釋放百分率[20-23]:

1.4 固體分散體的物相鑒定

1.4.1 掃描電鏡 精密稱取少量固體分散體、PVP-K30、黃酮、物理混合物樣品涂布在帶有雙面黏附膠的玻璃片上,操作電壓為20 kV,并在氬氣環境下噴金,采用SEM觀察不同樣品粒子表面的微觀形態。

1.4.2 XRD分析 分別對黑果枸杞總黃酮、PVP-K30、物理混合物及固體分散體進行粉末XRD。工作參數:使用CuKa靶射線為發射源,電壓40 kV:電流100 mA:掃描速度8 °/min,掃描范圍10～80 °。取約待測樣品粉末50 mg,壓成薄片后測定。

1.4.3 熱重(TGD)分析 黑果枸杞總黃酮、PVP-K30、物理混合物及總黃酮固體分散體適量,分別置于TGA的鋁盤中,以氧化鋁為參比物,升溫速度10 ℃/min,升溫范圍0～700 ℃,橫坐標為溫度,縱坐標為失重百分數表示,在氮氣環境下測定其熱曲線。

1.5 數據處理

采用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 載體類型的選擇 由圖1可知,黑果枸杞總黃酮固體分散體累積釋放百分率均明顯高于原料藥和物理混合物,15 min時達到最高,基本達到平衡。到30 min時,PVP-K30、PEG8000、F68三種載體為主的固體分散體累積釋放百分率分別達到80.2%、62.3%、65.4%,而原料藥僅有20.3%,固體分散體的溶出速度比黃酮高出3～4倍,其中PVP-K30效果較佳,原因可能是PVP-K30粘度增大而抑制藥物晶核的形成及成長,使藥物呈無定形態,從而增加其在水中的溶解度。于對于難溶性藥物而言,利用水溶性載體制備的固體分散物,PVPK30可以提高黑果枸杞總黃酮的潤濕性,在分散體中總黃酮分子被載體分子包圍,與水接觸后,載體分子迅速溶解,藥物潤濕,從而增加了溶出速率。另外載體可以使總黃酮保持高度分散狀態,藥物成分散狀態而不聚集成,從而增加了藥物的溶出度。

圖1 載體類型對黑枸杞總黃酮固體分散體累積釋放百分率的影響Fig.1 Effect of carrier type on total dissolution percentage of total flavonoids of black fruit Lycium barbarum

2.1.2 原料與載體材料比例的篩選 由圖2可知,原料藥和載體比例在1∶2、1∶3、1∶4時,30 min時累積釋放百分率分別可以達到75.6%、86.4%、78.6%,比黃酮的累積釋放百分率高出4倍。其中PVP-K30與黃酮比在1∶3時所形成固體分散體累積溶出百分率較高,達到86.4%。雖然物理混合物的累積釋放百分率比原料藥有所提高,但是低于載體和黃酮形成的固體分散體的累積釋放百分率,原因是物理混合物只能是載體的增溶,而固體分散體的增溶來自于高分散性、粒徑、晶型的綜合作用。載體的固體分散體,藥物在固體分散體中高度分散、形成一種固體形式存在的分散系統,載體在其中起到阻延藥物結晶和增加藥物可濕性的作用。

圖2 原料藥與載體比例對黑枸杞總黃酮固體分散體累積溶出百分率的影響Fig.2 Effect of proportion of raw material medicine on total dissolution percentage of total flavonoids of black fruit Lycium barbarum

2.1.3 攪拌時間的篩選 由圖3可知,隨著攪拌時間的延長,固體分散體累積釋放百分率逐漸增加均高于黃酮和物理混合物,攪拌時間分別為45、60、75 min時達到最高即72.0%、80.9%、89.1%。再次延長攪拌時間,累積溶出百分率反而有下降趨勢,其原因主要為隨著攪拌時間的延長黃酮均勻分散在載體中溶解度增加,但是溶出一定時間后趨于過飽和狀態,黃酮累積釋放百分率降低,其中攪拌時間在75 min時,30 min內其累積溶出百分率可達到89.1%,而90 min時累積溶出百分率為63.9%,比30 min還低,因此分別取45、60、75 min進行正交試驗。

圖3 攪拌時間對黑枸杞總黃酮固體分散體累積溶出百分率的影響Fig.3 Effect of mixing time on total dissolution percentage of total flavonoids of black fruit Lycium barbarum

2.2 正交試驗結果

根據單因素實驗結果,選取載體的類型、原料與載體的比例、攪拌時間進行三因素三水平的正交試驗,試驗結果(表2)可以看出,載體的類型,原料藥與載體的比例對黑枸杞總黃酮固體分散體的累積溶出百分率產生不同程度的影響,而且影響顯著(p<0.05),各因素對黑枸杞總黃酮固體分散體的累積溶出百分率影響主次序為B>A>C,最佳工藝組合為A1B2C3,即載體為PEG6000、比例為1∶3、攪拌時間為75 min。在此結果上,進一步進行驗證試驗,黑枸杞總黃酮固體分散體的累積溶出百分率可達到90.3%,為黑果枸杞總黃酮固體分散體的制備工藝最佳條件,正交試驗結果及方差分析見表2、表3。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 方差分析結果Table 3 Variance analysis results

2.3 固體分散體的物相表征

2.3.1 掃描電鏡 結果顯示四種不同樣品表面結構完全不同。黑果枸杞總黃酮和PVP-K30以大小不一的結晶體存在,而固體分散體中沒有明顯晶體存在,表明藥物在PVP作用下形成共沉淀物以無定形形式存在,形成固體分散體。物理混合物可以看出是多種物質的簡單混合狀態,即有晶體又有粉末,結果見圖4a～圖4d。

圖4 掃描電鏡圖Fig.4 SEM picture注:a:固體分散體掃描電鏡圖;b:PVP-K30掃描電鏡圖;c:黑果枸杞總黃酮掃描電鏡圖;d:物理混合物掃描電鏡圖。

2.3.2 XRD分析 X-射線衍射掃描圖譜結果見圖5(a～d),圖5a為黑果枸杞總黃酮XRD圖,在10～30 °有2個衍射峰,圖5b為物理混合物的XRD圖,在10～30 °有2個衍射峰,是黑果枸杞總黃酮和PVP-K30各自譜線的疊加,藥物特征晶體峰仍明顯存在,但強度減弱。圖5c為PVP-K30的XRD圖,也有2個衍射峰,第一個衍射峰強度增加,而圖5d為黑果枸杞總黃酮固體分散體的XRD圖,2個衍射峰合為較寬的一個衍射峰,說明黑果枸杞總黃酮熔在載體材料中,藥物吸收峰被掩蓋,說明制成固體分散體以后,總黃酮在固體分散體中以無定形態存在,這為其溶解度和溶出度的提高提供了依據。

圖5 X-射線衍射掃描圖譜Fig.5 X-ray diffraction scan 注:a:總黃酮;b:物理混合物;c:PVP-K30;d:固體分散體。

2.3.3 熱重(TGD)分析 TGA圖6(a～c)顯示,黑果枸杞總黃酮、PVP-K30、物理混合物在50～450 ℃范圍內穩定,溫度高于450 ℃時開始分解。而TGA圖6d顯示,在150 ℃左右熱穩定性下降,是由總黃酮與載體材料以適當比例混合,形成共沉淀無定形物,有時稱玻璃態固熔體,分子進入PVP分子的網狀骨架中,藥物晶體受到PVP的抑制而形成非結晶性無定形固體分散體,固體分散體熱熔溫度下降,可以提高黃酮溶出速度。

圖6 熱重分析圖Fig.6 Thermogravimetric analysis注:a:總黃酮;b:物理混合物;c:PVP-K30;d:固體分散體。

3 結論

本研究在試驗過程中對總黃酮中間體性質也進行考察,過程中發現中間體總黃酮難溶于水,屬于難溶性藥物。若將提取物總黃酮直接口服給藥將影響藥物的生物利用度,不能正常的發揮藥效。在制劑過程中,考慮采用固體分散技術來提高難溶性藥物的溶解性能,增加藥物的溶解速度及溶出速率,改善藥物的吸收及生物利用度[24-25],所以本研究以黑果枸杞總黃酮為原料,以PEG6000為載體制備固體分散體,按照1∶3比例采用溶劑法制備黑果枸杞總黃酮固體分散體,原料藥在60 min時累積釋放百分率僅有20.3%左右,而固體分散體30 min就可以達到89.3%。而且本實驗所用黑果枸杞的研究比較少,并沒有成品用于臨床和實際應用,在市面上未見類似產品。

因此通過上述研究可以為進一步開發研究黑果枸杞新產品,加快黑果枸杞精深加工發展步伐,進一步促進現代黑果枸杞中藥材研究開發、生產制造新藥開發及中藥現代化的發展提供理論依據和試驗基礎。