紅樹莓籽中活性物質提取工藝優化

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(1.東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040; 2.黑龍江童醫兒童生物制藥有限公司,黑龍江哈爾濱 150040)

紅樹莓(RubusideausL.)屬薔薇科懸鉤子屬,俗名覆盆子、托盤等。紅樹莓中含有大量的活性物質,如多酚、黃酮、原花青素等[1-2]。其活性成分可用于抗癌、抗腫瘤等重癥治療[3-4]。紅樹莓籽作為紅樹莓的副產物,其營養物質豐富[5-7],含有人體必需的不飽和脂肪酸[8]和豐富的抗氧化活性物質,具有積極的生理功效[9]。

趙金璐等[10]通過動物實驗研究得出樹莓提取物能抑制肝癌細胞PCNA的表達,起到抑制其增殖的作用。李萌萌[11]等發現紅樹莓籽黃酮具有較高的抗氧化活性,能夠清除人體中超氧離子自由基,具有抗癌細胞增殖作用,同時還具有強化免疫系統功能、降血壓等功效[12-13]。目前對紅樹莓籽原花青素的功能研究較少,僅在分離和純化上有所研究。張佰清等[14-15]通過大孔吸附樹脂分離出較高純度的原花青素并測定了從中分離出的三條色譜帶的平均聚合度。在加工過程中,大量的樹莓籽作為副產品或生產廢物,因缺乏有效的提取工藝而沒有得到開發和利用。

本實驗為闡明紅樹莓籽中多酚、黃酮、原花青素提取的影響因素,從乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比、pH等方面進行研究,并通過優化獲得最佳提取條件,以期為紅樹莓果籽的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓(秋福) 尚志市采摘后-10 ℃冷凍保存;福林酚 北京新天創高科技有限公司;香草醛 天津市致遠化學試劑有限公司;兒茶素、沒食子酸、蘆丁標準品 上海源葉生物科技有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃硫酸、濃鹽酸、無水乙醇 均為市售分析純。

DL-6M高速離心機 湖南星科科學儀器有限公司;RE-2000A旋轉蒸發儀 鞏義市予華儀器有限責任公司;722可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;RT502分析天平 常熟市意歐儀器儀表有限公司;JYL-C23 九陽料理機 九陽股份有限公司;P70F23P-G5(S0) 微波爐 廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司;ND7-2L 球磨機 南京南大天尊電子有限公司;SHZ-C水浴恒溫振蕩器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;DK-8D電熱恒溫水槽 鞏義市予華儀器有限責任公司;DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱 鞏義市予華儀器有限責任公司;PHS-3E型PH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;KQ-300DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅樹莓籽活性物質的提取工藝

1.2.1.1 紅樹莓籽脫脂粉的制備 取1 kg于-10 ℃中保存的紅樹莓凍果于微波爐中(解凍擋位)解凍6 min,解凍后的紅樹莓果用榨汁機粉碎成勻漿狀。榨汁后的樹莓果漿用雙層紗布過濾取籽,之后將紅樹莓籽放于80 ℃烘箱中烘干2 h。烘干后的樹莓籽通過球磨機進行磨粉,過120目篩。使用正己烷作為溶劑在40 ℃條件下超聲脫脂20 min后抽濾得到紅樹莓籽脫脂粉。

1.2.1.2 紅樹莓籽脫脂粉活性物質的提取 使用乙醇作為提取溶劑,在控制一定的乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比、pH 5個條件下對紅樹莓籽中活性成分進行提取,提取液在4000 r/min,20 ℃的條件下離心10 min,之后在45 ℃,0.1 MPa的條件下真空濃縮30 min除去溶劑。用蒸餾水定容至100 mL置于-10 ℃環境中冷藏備用。

1.2.2 乙醇提取法的單因素實驗設計 按照1.2.1.2的方法,以多酚,黃酮,原花青素含量為指標,在pH為4,50 ℃的條件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取3 h,探討不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)對紅樹莓籽活性物質提取含量的影響;使用60%乙醇進行提取,在pH為4的條件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取,探討不同提取時間(1、2、3、4、5 h)對紅樹莓籽活性物質提取含量的影響;使用60%乙醇進行提取,在pH為4的條件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取3 h,探討不同提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對紅樹莓籽活性物質提取含量的影響;使用60%乙醇進行提取,在pH為4,50 ℃的條件下提取3 h,探討不同料液比(1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55)對紅樹莓籽活性物質提取含量的影響;使用60%乙醇進行提取,在50 ℃的條件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取3 h,探討不同pH(2、3、4、5、6)對紅樹莓籽活性物質提取含量的影響。

1.2.3 響應面優化試驗設計 根據Box-Behnken實驗設計原理進行四因素三水平實驗設計,利用Design-Expert 8.0軟件設計,以多酚提取含量為指標,進行數據擬合優化紅樹莓籽活性物質提取工藝。在單因素試驗的基礎上,自變量的實驗水平分別以-1、0、1進行編碼,共設計29個實驗點。響應面試驗因素及水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 紅樹莓籽活性物質提取含量的測定

1.2.4.1 紅樹莓籽中多酚提取含量的測定 采用福林酚法[16]測定紅樹莓籽多酚提取含量。以沒食子酸為標準品,沒食子酸濃度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mg/mL)為橫坐標,765 nm處吸光度為縱坐標。其線性回歸方程為y=8.8503x+0.0111(R2=0.9991)。紅樹莓籽多酚提取含量以每克脫脂干紅樹莓籽粉中總酚的毫克數表示。

1.2.4.2 紅樹莓籽中黃酮提取含量的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[17]測定紅樹莓籽總黃酮提取含量。以蘆丁為標準品,蘆丁濃度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mg/mL)為橫坐標,510 nm處吸光值為縱坐標。其線性回歸方程為y=1.0229x+0.0003(R2=0.9992)。紅樹莓籽黃酮提取含量以每克脫脂干紅樹莓籽粉中黃酮的克毫數表示。

1.2.4.3 紅樹莓籽中原花青素提取含量的測定 采用香草醛-硫酸法[18]測定紅樹莓籽原花青素提取含量。以兒茶素為標準品,兒茶素濃度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mg/mL)為橫坐標,500 nm處的吸光值為縱坐標。其線性回歸方程為y=1.6957x-0.0010(R2=0.9994)。紅樹莓籽原花青素提取含量以每克脫脂干紅樹莓籽粉中原花青素的毫克數表示。

1.2.4.4 紅樹莓籽中多酚,黃酮,原花青素計算公式 總酚/總黃酮/原花青素提取量(mg/g)=(C×V×n)/m;式中:C代表根據回歸方程計算得到的質量濃度(mg/mL),V代表提取液總體積(mL),n代表稀釋倍數,m代表脫脂干紅樹莓籽粉末的質量(g)。

1.3 數據處理與分析

采用Excel、Origin Pro 8.1、Design-Expert 8.0軟件對數據進行處理與分析。每組實驗重復三次,實驗數據以x±s表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對紅樹莓籽中活性物質提取量的影響 如圖1所示,當乙醇濃度在40%～60%時,多酚的提取含量隨乙醇濃度增加而增加,當乙醇濃度為60%時,多酚的提取含量達到最大值為(31.91±0.52) mg/g。此時黃酮和原花青素的提取含量也達到最大,黃酮的提取含量為(15.22±0.43) mg/g,原花青素為(18.98±0.39) mg/g;當乙醇濃度高于60%,多酚的提取含量開始下降。乙醇濃度對黃酮的提取含量影響與李萌萌等[6]實驗結果相似,對原花青素的影響與吳迪[12]的實驗結果相似。這可能是乙醇濃度增大了其他物質的溶出從而抑制了還原性物質的提取[19]。當乙醇濃度較高時,色素、醇溶性雜質等物質溶解,這些物質影響了活性物質與醇結合的能力,同時,高濃度的乙醇會降低細胞的通透性,從而抑制活性物質的析出,使其提取含量降低[20]。綜合上述情況,最佳乙醇濃度范圍選擇40%～60%。

圖1 乙醇濃度對紅樹莓籽活性物質提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.2 提取時間對紅樹莓籽中活性物質提取量的影響 如圖2所示,三種活性物質的提取含量隨提取時間的增長均為先上升后下降的趨勢。當提取時間為4 h時,多酚和原花青素的提取含量都達到最大值分別為35.13、20.92 mg/g;黃酮的提取含量在3 h時達到最大為15.30 mg/g;綜合上述情況,最佳提取時間范圍選擇3～5 h。三種活性物質的提取含量隨提取時間變化的原因是隨著提取時間的延長,活性物質的溶出率隨之增加,但當提取時間過長時,多酚類物質隨之溶解,導致活性物質提取含量降低。

圖2 提取時間對紅樹莓籽活性物質提取量的影響Fig.2 Effects of extraction time on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.3 提取溫度對紅樹莓籽中活性物質提取量的影響 如圖3所示,隨著提取溫度的升高,多酚的提取含量先增加后減少;當提取溫度為50 ℃時,多酚與黃酮的提取含量達到最大值分別為30.83、15.34 mg/g。原花青素在實驗提取溫度范圍內隨提取溫度升高提取含量降低,30 ℃時提取含量最大為19.45 mg/g。綜合上述情況,選擇最佳提取溫度范圍為40～60 ℃。多酚與黃酮提取含量變化原因是當提取溫度升高時,分子加速運動,導致樹莓籽中多酚、黃酮等物質結合的氫鍵容易斷裂,從而使他們的析出率增加,擴散速度加快,最終使其提取含量增加。同時,將提取溫度繼續升高,當超過50 ℃時,多酚與黃酮等物質結合的氫鍵斷裂后存在不穩定,過高的提取溫度也可能會導致析出的多酚和黃酮被氧化或降解等一系列不可逆反應,使析出的活性物質有所損失,從而導致提取含量降低[21]。

圖3 提取溫度對紅樹莓籽活性物質提取量的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.4 料液比對紅樹莓籽中活性物質提取量影響 如圖4所示,隨著料液比的升高,多酚的提取含量先增加后減少,當料液比到達1∶45 (g/mL)時,多酚的提取含量達到最大值為35.65 mg/g。當料液比為1∶15～1∶35 (g/mL)時,黃酮與原花青素的提取含量隨之升高之后趨于平穩。因此,選擇最佳料液比范圍為1∶35～1∶55 (g/mL)。料液比對活性物質提取含量的影響與李萌萌等[6]的實驗結果相似,黃酮提取含量均在料液比為1∶35 (g/mL)時達到最大。可能是隨著料液比的增大,通過提高溶劑用量,可以增加質量濃度梯度,活性物質從紅樹莓籽組織內向外擴散過程中,固液間質量濃度梯度是提取物發生轉移的動力,濃度梯度和擴散速率升高,有利于活性物質的溶出,導致活性物質提取含量的提高;但當料液比達到某一極限后,再提高料液比收效不大或抑制活性物質的滲出。

圖4 料液比對紅樹莓籽活性物質提取量的影響Fig.4 Effects of ratio of solid to solvent on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.5 pH對紅樹莓籽中活性物質提取量的影響 如圖5所示,pH對多酚和原花青素的提取含量影響不大,多酚的提取含量在pH為2和6時相對較高，在pH=6時最大為35.18 mg/g。黃酮和原花青素的提取含量隨pH的增大呈現先上升后下降的趨勢,提取含量在pH=3達到最大為17.19、21.28 mg/g。pH對多酚的提取含量影響與曠慧等[22]實驗結果相似。可能原因是強酸性條件破壞了化學鍵,使結合力強的多酚被提取出來;或破壞了低聚/多聚酚類物質間的結合力,使單體多酚游離出來;或者可能是在pH=4.5～5.0多酚氧化酶活性較高,分解了多酚類物質從而導致多酚的提取含量稍有下降[23]。

圖5 pH對紅樹莓籽活性物質提取量的影響Fig.5 Effects of pH on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.2 響應面優化提取工藝

響應面試驗及結果如表2所示。

利用Design-Expert 8.0對表3數據進行多元回歸擬合,獲得多酚提取含量(Y)對自變量料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、乙醇濃度(D)的二元多項回歸模擬方程:

Y=38.03+1.21A+0.70B-0.32C-0.14D-1.17AB-0.63AC-0.60AD-0.34BC-0.36BD-0.071CD-2.85A2-0.63B2-0.80C2-1.53D2

Box-Benhnken中心組合實驗設計及結果、方差分析分別見表2、表3。

表2 Box-Benhnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of the regression model

圖6 因素交互作用對多酚提取含量響應面圖Fig.6 Response surface plots for the effects of different factors on the extraction rate of polyphenols

利用Design-Expert 8.0分析得到最佳條件工藝為:料液比1∶50.37 (g/mL)、提取溫度50.61 ℃、提取時間3.48 h、乙醇濃度57.22%。考慮實際情況,將以上條件校正為:料液比1∶50 (g/mL)、提取溫度51 ℃、提取時間3.5 h、乙醇濃度57%。根據響應面法優化條件進行驗證實驗,最終得到多酚提取含量Y=(38.32±0.25) mg/g,與預測值38.4761 mg/g相差0.41%,因此可確定其為最佳工藝條件,此時,測得黃酮與原花青素的提取含量分別為(17.50±0.14)和(19.71±0.27) mg/g。

3 結論

紅樹莓籽中活性物質的最佳提取工藝為:料液比1∶50 (g/mL)、提取溫度51 ℃、提取時間3.5 h、乙醇體積分數57%、pH=3。在此工藝條件多酚的提取含量為(38.32±0.25) mg/g,黃酮提取含量為(17.50±0.14) mg/g,原花青素提取含量為(19.71±0.27) mg/g。本實驗通過響應面法得到了紅樹莓籽中活性物質的最佳提取工藝,為紅樹莓果籽的綜合利用提供理論依據。