響應面優化藜麥糠黃酮類化合物的提取及其抗氧化性研究

,,,,

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

藜麥(Chenopodiumquinoawilld),原產于南美洲的玻利維亞、厄瓜多爾和秘魯。在歐洲、非洲與亞洲普遍為實驗性種植。隨著藜麥作為公認的“全能食物”在全球的盛行[1-2],1987年藜麥引入我國西藏,因其需要特殊的培育種植環境,目前在山西、四川、青海、陜西等地均建立了藜麥實驗種植區[2]。藜麥富含纖維素,多不飽和脂肪酸種類豐富,各類維生素及多種礦物質含量普遍高于普通谷類[3]。在抗氧化、降血壓降血脂、消炎抗菌等方面天然黃酮效果極為明顯,近年來存在于植物中的天然黃酮類化合物多用于藥品及保健品的開發。藜麥中含量較高生物活性物質具有防癌、消炎、降血壓、減脂等生理活性,如:蘆丁、異槲皮素、槲皮素、山奈酚等,特別是藜麥類黃酮中的槲皮素與其苷類化合物的抗腫消炎、抗氧化的效果極為明顯[4]。

目前,對于藜麥籽粒中營養組成、健康功效及其在食品中應用現狀的研究和報道詳細[5-6],梁彬等[7]采用微波輔助提取藜麥種子總黃酮提取量為6.5 mg/g。孫雪婷等[8]利用乙醇浸提法提取藜麥種子黃酮提取得率2.64 mg/g,董晶等[9]利用超聲波法提取藜麥黃酮提取率為0.31%,陸敏佳等[10]利用乙醇回流法提取藜麥葉片黃酮提取得率為0.619%等。上述研究多集中在籽粒,且籽粒中黃酮含量較低,而關于藜麥糠中黃酮的研究卻鮮有報道。藜麥糠作為藜麥的副產品,應加以開發和利用。本實驗以藜麥糠為原料,利用超聲波輔助提取其中的黃酮類化合物,在優化提取工藝的基礎上進一步對其抗氧化活性進行研究,以期提高對藜麥的綜合開發與利用價值,為藜麥副產物的充分利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

藜麥糠 山西省華青藜麥產品開發有限公司;蘆丁標準品(AR≥98%)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(AR≥95%) 美國Sigma公司;其他所用試劑 均為分析純。

HRHS24型電熱恒溫水浴鍋 青島海爾醫用低溫科技有限公司;JP-040ST 型超聲波清洗機 深圳市潔盟清洗設備有限公司;TG16A-WS型高速離心機 武漢愛斯佩科學儀器有限公司;SP-2000UV型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥糠黃酮的提取 通過索氏提取法去除樣品中油脂等雜質(GB/T5009.62003)。然后精密稱取一定質量樣品粉末于干燥燒杯中,加入乙醇溶液浸泡10 min后利用超聲波清洗器輔助提取,結束后經過4000 r/min離心20 min后收集上清液進行真空抽濾,濾液備用。

1.2.2 藜麥糠黃酮得率的測定 將蘆丁標準品經過110 ℃恒溫干燥至恒重并冷卻至室溫備用,配濃度0.186 mg/mL標準溶液。分別精密吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL蘆丁標準品溶液于20 mL具塞試管中。30%乙醇補至5 mL,搖勻,向各組加入5%亞硝酸鈉0.3 mL,10%硝酸鋁溶液0.3 mL,靜置5 min,加4%氫氧化鈉溶液2.0 mL,待其充分反應,分別補加30%乙醇溶液至10 mL,搖勻后靜置}于510 nm處測定吸光度。記錄數據,并繪制以吸光度為縱坐標以濃度為橫坐標的標準曲線[11],所得回歸方程為Y=0.9932X+0.044(R2=0.991),式中Y為吸光度;X為蘆丁質量濃度(mg/mL)。

測定樣液時,精密吸取1 mL樣液于具塞試管中,按照1.2.2的方法處理,在510 nm處測定其吸光度。根據公式(1)求出樣品中黃酮的得率:

式(1)

式中,Y為樣品中黃酮的得率(%),W為藜麥糠粉末重量(g),C為根據標準曲線得的樣液黃酮濃度(mg/mL),V為定容體積(mL),N為稀釋倍數。

1.2.3 單因素實驗 實驗考察了乙醇濃度、液料比、超聲時間和超聲溫度等因素對樣品中黃酮類化合物得率的影響。稱取2.00 g已預處理的藜麥糠粉末。固定乙醇濃度60%,超聲時間為20 min,超聲溫度為60 ℃,考察液料比在10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g條件下黃酮類化合物的得率。固定液料比為30∶1 mL/g,超聲時間為20 min,超聲溫度為60 ℃,考察乙醇濃度在50%、60%、70%、80%、90%條件下黃酮類化合物的得率。固定液料比為30∶1 mL/g,乙醇濃度60%,超聲溫度為60 ℃,考察超聲時間在10、20、30、40、50 min條件下黃酮類化合物的得率。固定液料比為30∶1 mL/g,乙醇濃度60%,超聲時間為20 min,考察超聲溫度在30、40、50、60、70 ℃條件下黃酮類化合物的得率。

1.2.4 響應面試驗設計 以單因素實驗結果為基礎,按照Box-Behnken設計試驗[12],其因素與水平設計見表1。

表1 響應面優化試驗因素水平表Table 1 Levels and factors of the response surface experiment

1.2.5 藜麥糠黃酮類化合物抗氧化實驗

1.2.5.1 清除DPPH自由基的測定方法 按照由響應面實驗得出的最佳提取方案提取黃酮類化合物,并將其稀釋處理。得到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的黃酮提取液,以同濃度的VC作為對照進行實驗[12]。取1.0 mL不同質量濃度的黃酮提取液于試管中,分別加入0.052 mg/mL DPPH溶液1.0 mL,搖勻后將其在避光條件下放置30 min得到Ax,設置空白對照為2.0 mL乙醇、對照組A0為1.0 mL DPPH與1.0 mL乙醇混合液記為[13]。反應充分后于517 nm處測定并記錄其吸光度值,按照公式(2)計算DPPH的清除率。

式(2)

1.2.5.2 清除羥自由基(·OH)的測定方法 配制9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液備用與8.8 mmol/L H2O2溶液。配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的黃酮提取液,以同濃度的VC作為對照進行實驗。取各質量濃度的黃酮類化合物提取液1.0 mL于試管中,向各試管中分別依次加入1.0 mL已配制好的FeSO4、1.0 mL的水楊酸-乙醇溶液。再依次在試管中加入1.0 mL已配制的H2O2,將加好藥品的試管置于水浴鍋中設置溫度為37 ℃,30 min后于510 nm波長處得到樣品組吸光度Ax。將樣品組的H2O2用蒸餾水代替其他步驟同上得到對照組吸光度Ay。A0記為用蒸餾水代替樣品得到對照組吸光度[14],按公式(3)計算清除率。

式(3)

1.2.6 數據處理 采用Design-Expert V8.0.6軟件進行實驗數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 液料比對黃酮類化合物得率的影響 由圖1可知,當液料比低于20∶1 mL/g時得率隨著液料比的增大逐漸上升,20∶1 mL/g時達到最大0.887%,隨后得率反而逐漸降低。推測原因可能是在液料比小于20∶1 mL/g時,由于溶劑的增加增大了提取液乙醇與提取物藜麥糠的接觸面積,使溶出的黃酮類化合物量增大;液料比20∶1～30∶1 mL/g之間黃酮得率趨于平緩,雖減小但并不明顯,黃酮類化合物的溶出逐漸趨于動態平衡[14],在液料比大于20∶1 mL/g后得率下降是由于其它雜質的溶出對黃酮化合物產生拮抗作用。可見,當液料比為20∶1 mL/g時,藜麥糠中黃酮類化合物的得率相對較高。

圖1 液料比對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of liquid/solid ratio on flavonoid yield

2.1.2 乙醇濃度對黃酮類化合物得率的影響 由圖2可知,乙醇濃度在50%～60%黃酮得率為先上升趨勢,體積分數為60%達得率最大0.884%,在乙醇濃度大于60%時,黃酮得率逐漸降低,當乙醇濃度為90%時,其得率為實驗范圍內最低。根據相似相溶原理,推測黃酮類化合物的極性與60%乙醇溶液最為接近,并且在乙醇濃度為60%時,黃酮類物質溶出趨于飽和。當體積分數繼續增大時,由于其他醇溶性的雜質等的析出[15],由此可知,當乙醇濃度為60%時,藜麥糠中黃酮類化合物的得率較高。

圖2 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on flavonoid yield

2.1.3 超聲時間對黃酮類化合物得率的影響 由圖3可知,在超聲時間為10～30 min時,黃酮得率呈先升高而后略微降低的趨勢,在超聲時間為30 min之后黃酮得率基本保持不變。在超聲時間為20 min時得率達最大值0.74%,在20 min以后得率略微減小且均在0.6%左右。在超聲時間20 min之內,由于時間的延長,物料與乙醇溶液逐漸充分接觸,使物料中黃酮類化合物能充分地溶出。當時間延長至20 min后,有可能使溶出的黃酮類物質發生降解或也伴隨其他雜質的溶出[15],故得出最適超聲時間為20 min。

2.1.4 超聲溫度對得率的影響 由圖4可知,超聲溫度較低于40 ℃時提取較為困難得率較低,低于0.5%;隨著提取溫度的升高,得率也逐漸增加,在超聲溫度高達50 ℃時得率達到最大值0.889%,之后繼續升高溫度得率反而降低,在70 ℃時,得率降至 0.5%左右。經分析此變化產生的原因可能是,在溫度在低于50 ℃時隨著溫度的升高,物料內分子運動速率逐漸增加,使黃酮類化合物更容易溶出[15]。但在50 ℃以上,高溫使提取液中其他雜質成分與黃酮類化合物發生化學反應出現絮狀沉淀,導致有效成分減少[16],且溫度高于60 ℃時溶劑揮發量增加導致得率降低,故得出超聲溫度50 ℃為最適溫度。

圖4 超聲溫度對黃酮得率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on flavonoid yield

2.2 響應面分析及藜麥糠黃酮類化合物工藝優化

利用Design-Expert V8.0.6軟件的Box-Behnken設計,以液料比、乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度為響應變量,黃酮得率為響應值,進行響應面實驗,結果如表2所示。

表2 Box-Behnken方案及結果Table 2 Box-Behnken test design and results

2.2.1 模型建立和顯著性分析 由表3可知,得到回歸方程為:

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the regression equation

Y=0.80-0.019A-0.045B-0.034C-0.017D-0.019AB+0.00825AC+0.015AD+0.039BC+0.028BC+0.003CD-0.12A2-0.086B2-0.091C2-0.029D2

由表3與回歸方程分析可知,p<0.001,則顯示模型為極顯著,此模型中失擬性不顯著,表示此模型設計預測值能與實際值相近,有良好的線性關系,根據此模型不僅可以得到藜麥糠黃酮類化合物提取的最優工藝,并且可以真實的反映藜麥糠中的黃酮類化合物含量。由表3可知,從F值可以看出:對于本實驗黃酮類化合物的提取影響因素排序為:B乙醇濃度>C超聲溫度>A液料比>D超聲時間。實驗因素中,一次項:A、D,交互項BD對實驗結果有著顯著影響,而一次項:B、C,交互項BC及各二次項均對實驗結果為極顯著的影響,而其余項對實驗指標影響不顯著[17-18]。

2.2.2 響應面交互作用分析 根據表2設計,經過Densign-Eexpert 8.0分析得知,固定一個因素為0水平,分析另外兩個因素的交互作用對藜麥糠黃酮類化合物得率的影響,兩因素交互作用的影響如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對黃酮類化合物得率的影響Fig.5 Response surface graphs showing the effect of extraction conditions on the yield of flavonoid

在其他實驗因素固定不變的情況下,考察交互項對得率的影響,響應面分析圖可用于評價實驗因素對黃酮得率影響的交互作用。在兩因素交互作用3D圖中,圖形的坡度越陡,表明響應指標對響應因素的變化越敏感[19-20]。在交互相對得率的影響中,乙醇濃度與超聲溫度和乙醇濃度與超聲時間之間交互作用明顯,而其他因素兩兩交互作用對得率影響并不明顯,這與方差分析結果一致。

由Design-Expert分析,藜麥糠黃酮類化合物提取的最優提取工藝為乙醇濃度為56%,液料比為20∶1 mL/g,超聲時間為14 min,超聲溫度為58 ℃,預測得率為0.821%。按照上述工藝條件,進行三次重復實驗,實際得率為0.802%±0.012%。故此條件具有可靠性和可操作性。

2.3 抗氧化性實驗結果與分析

2.3.1 藜麥糠黃酮類化合物提取物的DPPH清除能力 由圖6可知,VC溶液的DPPH清除能力隨著其濃度變化在濃度0.1～0.2 mg/mL之間清除率變化最小,在0.2～0.3 mg/mL時清除率變化最大。黃酮提取液于0.1～0.3 mg/mL時,其清除率呈線性增加。提取液濃度范圍在0.3～0.4 mg/mL時,其清除率增加顯著,而在0.4 mg/mL后,其DPPH清除率增加較為緩慢[21]。但黃酮類化合物提取液的清除能力始終弱于VC,在質量濃度較低小于0.2 mg/mL時,兩者DPPH清除能力均較弱且相差不大,在本實驗中VC質量濃度在0.5 mg/mL時清除率達89%,同濃度黃酮類化合物提取液的DPPH清除率達64%左右,表明藜麥糠黃酮類化合物提取液有良好的自由基清除能力。

圖6 藜麥糠黃酮類化合物提取物的DPPH清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging capacity of flavonoid from Chenopodium quinoa bran

2.3.2 藜麥糠黃酮類化合物提取物的羥自由基(·OH)清除能力 由圖7可知,黃酮提取液的羥自由基清除能力與其質量濃度成正比[22],在二者質量濃度小于0.3 mg/mL時黃酮類化合物提取液清除率遠低于VC。當二者質量濃度高于0.3 mg/mL后,二者清除率能力相差不大,在0.3 mg/mL時二者清除率最為接近。黃酮類化合物提取物質量濃度為0.5 mg/mL時的羥自由基清除率達77%,在此濃度下其清除羥自由基能力與VC相差不大。但總體來說,樣液羥自由基清除能力的趨勢與VC大致相似。

圖7 藜麥糠黃酮類化合物提取物的羥自由基(·OH)清除能力Fig.7 Hydroxyl free radical scavenging capacity of flavonoid from Chenopodium quinoa bran

3 結論

以藜麥糠為原料,借助超聲波輔助提取藜麥糠黃酮類化合物,通過響應面優化提取工藝,并對其提取物進行抗氧化實驗分析。實驗得出最佳的提取條件為:乙醇濃度56%,液料比20∶1 mL/g,超聲時間14 min,超聲溫度58 ℃,在此條件下黃酮的得率為0.802%±0.012%。按響應面設計最佳提取條件,進行三次重復實驗實際得率為0.802%,與預測值大致相符。此外,進行了藜麥糠黃酮類化合物的抗氧化性實驗測定。表明,藜麥糠黃酮作為一種天然的抗氧化劑,具有與VC相當的清除羥自由基清除能力和較強的DPPH清除能力。此實驗為藜麥糠中生物活性物質的開發提供了重要依據。