超聲波輔助法提取假蘋婆樹葉總黃酮及其清除羥自由基能力

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(1.廣西民族師范學院化學化工學院,廣西崇左 532200; 2.廣西高校桂西南特色植物資源化學重點實驗室培育基地,廣西崇左 532200)

假蘋婆(SterculialanoeolataCav.)為梧桐科植物,又稱為賽蘋婆、雞冠木,在我國的廣西、廣東和云南等地均有種植,是西南地區(qū)的特色樹種之一。假蘋婆的適應性強,可作為城市郊區(qū)生態(tài)風景林的混交樹種,也可作為風景樹和綠蔭樹[1],其根和葉可舒筋活絡,祛風活血,種子可以食用和榨油,全株具有清熱解毒,消腫止痛的功效。主治瘀血疼痛、青紫、腫脹、跌打損傷等癥[2]。黃酮類化合物不但具有抗氧化性,還具有抗腫瘤、抗菌和抗病毒活性[3-5]。提取黃酮類化合物的方法有超聲波輔助提取法、溶劑浸提法、微波輔助提取法、加壓流體提取法、超臨界CO2流體提取法等[6-8]。超聲波輔助提取法具有操作簡單,提取時間短,成本低等優(yōu)點,已經(jīng)應用于天然產(chǎn)物的提取研究[9-10]。

目前,有研究者對藜麥種子[11]、費菜[12]和香椿葉[13]等植物中的黃酮類化合物進行了提取和分離,而由于假蘋婆種植區(qū)域局限,對其樹葉中黃酮類化合物提取工藝及抗氧化活性的研究鮮有報道。本文以假蘋婆樹葉為原料,通過超聲波輔助提取假蘋婆樹葉中的黃酮類化合物,并對其抗氧化活性進行了研究,以期為更全面地開發(fā)利用假蘋婆提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

假蘋婆樹葉(樹齡:約20年) 2015年8月采摘于廣西民族師范學院;蘆丁標準品(生化試劑) 上海晶純試劑有限公司;氫氧化鈉(分析純) 廣東光華科技股份有限公司;95%乙醇、30%過氧化氫、抗壞血酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、水楊酸、七水合硫酸亞鐵等 均為分析純。

7200型可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;JA1003N電子天平 上海精密科學儀器有限公司;SG2200HPT型超聲波洗滌機 上海冠特超聲儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮提取工藝 將采摘后的假蘋婆樹葉洗凈,55 ℃下干燥24 h,利用中藥粉碎機粉碎,過60目篩,用石油醚以1∶25 (w/v)的比例浸泡,連續(xù)強力攪拌去除葉綠素,再在50 ℃下干燥8 h后得到假蘋婆樹葉粉末,常溫下避光保存?zhèn)溆谩Ｈ?.0000 g假蘋婆樹葉粉末,按照一定的料液比加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液,在一定的提取溫度下,按照一定的提取功率提取一定的時間。反應結束后,過濾,將濾液定容至100 mL,搖勻備用。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響 固定料液比1∶25 (g/mL)、提取溫度50 ℃、提取時間35 min、提取功率60 W,采用1.2.1方法提取假蘋婆樹葉粉末總黃酮并考察不同乙醇體積分數(shù)30%、40%、50%、60%、70%對總黃酮得率的影響。

1.2.2.2 提取功率對總黃酮得率的影響 固定乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶25 (g/mL)、提取溫度50 ℃、提取時間35 min,采用1.2.1方法提取假蘋婆樹葉粉末總黃酮并考察不同提取功率50、60、70、80、90 W對總黃酮得率的影響。

1.2.2.3 提取時間對總黃酮得率的影響 固定乙醇體積分數(shù)50%、提取功率60 W、料液比1∶25 (g/mL)、提取溫度50 ℃,采用1.2.1方法提取假蘋婆樹葉粉末總黃酮并考察不同提取時間25、35、45、55、65 min對總黃酮得率的影響。

1.2.2.4 提取溫度對總黃酮得率的影響 固定乙醇體積分數(shù)50%、提取功率60 W、提取時間55 min、料液比1∶25 (g/mL),采用1.2.1方法提取假蘋婆樹葉粉末總黃酮并考察不同提取溫度40、50、60、70、80 ℃對總黃酮得率的影響。

1.2.2.5 料液比對總黃酮得率的影響 固定乙醇體積分數(shù)50%、提取功率60 W、提取時間55 min、提取溫度70 ℃,采用1.2.1方法提取假蘋婆樹葉粉末總黃酮并考察不同料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)對總黃酮得率的影響。

1.2.3 正交試驗設計 在單因素實驗基礎上,選取乙醇體積分數(shù)、提取功率、提取時間、料液比四個因素,設計四因素三水平L9(34)正交試驗,以確定較優(yōu)假蘋婆總黃酮提取工藝,因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 總黃酮得率的測定 參考文獻[14]的方法,用60%(體積分數(shù),下同)的乙醇溶液配制50 mL 0.3 mg/mL的蘆丁標準溶液,準確吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL蘆丁標準溶液分別加入到10 mL比色管中,對應加入0.4 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻后放置6 min,再加0.4 mL 10%的Al(NO3)3溶液,搖勻后放置6 min,加入4.0 mL 4%的NaOH溶液,然后用60%的乙醇溶液定容,搖勻,靜置15 min。于510 nm處測定各溶液吸光度,以蘆丁質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得曲線方程為:y=44.638x+0.0028,R2=0.9994。按照蘆丁標準曲線的測定方法測定樣品液的吸光度,再由式(1)計算總黃酮得率。

式(1)

式中,C為根據(jù)蘆丁標準曲線計算出來的提取液質量濃度(mg/mL);V為樣品定容體積(mL);N為稀釋倍數(shù);M為假蘋婆樹葉干粉質量(mg)。

1.2.5 假蘋婆總黃酮清除羥自由基的活性測定 在比色管中加入0.5 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,再加入不同體積總黃酮提取液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5,0.5 mL 9.0 mmol/L Fe2+溶液,3.5 mL蒸餾水,再加入5.0 mL 88 mmol/L的H2O2溶液,搖勻后放置15 min,在510 nm處測定吸光度,記為A1;用0.5 mL蒸餾水代替Fe2+溶液,測得的吸光度記為A2;取0.5 mL蒸餾水代替總黃酮提取液測得的吸光度記為A3。各吸光度均平行測定三次,按式(2)計算羥自由基清除率P,最后取平均值。同時均以抗壞血酸作陽性對照。

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excle(Office 2010)、Origin8.5軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對假蘋婆樹葉總黃酮得率的影響 從圖1可以看出,當乙醇體積分數(shù)低于40%時,總黃酮得率較低,這是由于乙醇體積分數(shù)較小,水含量相對多,有較多水溶性成分溶出,使得總黃酮得率較低。當乙醇體積分數(shù)為50%時,總黃酮得率達到最大,說明假蘋婆樹葉中中等極性的黃酮類化合物含量較高。繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù),總黃酮得率減小,說明乙醇體積分數(shù)較大時,溶劑的極性降低,大量的脂溶性和醇溶性成分溶出,使黃酮類化合物溶解度降低,從而導致總黃酮得率減小[15]。因此,提取假蘋婆樹葉總黃酮的乙醇體積分數(shù)以50%為宜。

圖1 乙醇體積分數(shù)對假蘋婆總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on yield of the total flavonoids from the Sterculia lanceolata

2.1.2 提取功率對假蘋婆樹葉總黃酮得率的影響 由圖2所知,當超聲波功率為50 W時,總黃酮得率較低,這是由于功率較低,不足以使物料充分受到超聲波的作用。功率為60 W時,總黃酮得率最大,繼續(xù)增大提取功率,總黃酮得率降低,這是因為超聲波功率較大時,對黃酮類化合物具有破壞作用,故選取60 W為較佳提取功率。

圖2 提取功率對假蘋婆總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of power on yield of the total flavonoids from the Sterculia lanceolata

2.1.3 提取時間對假蘋婆樹葉總黃酮得率的影響 由圖3可知,提取時間為25～55 min時,總黃酮得率隨著時間的延長逐漸增大,其中,提取55 min總黃酮得率最大,繼續(xù)延長提取時間,總黃酮得率急劇減小。這是因為:一方面,提取時間較短時,假蘋婆中的黃酮類化合物沒有完全溶出,使得總黃酮得率低,55 min時,黃酮類化合物已基本溶出,再延長時間,提取出來的黃酮類化合物結構受到破壞,導致最后的提取率減小;另一方面,由Fick定律可知,提取率和時間具有正相關關系,但提取時間過長,擴散系數(shù)降低,影響總黃酮得率,且雜質的溶出量也會隨著提取時間的延長而增加,不利于后續(xù)分離純化[16-17]。綜合考慮得率和能耗,選取55 min為較佳提取時間。

圖3 提取時間對假蘋婆總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of time on yield of the total flavonoids from the Sterculia lanceolata

2.1.4 提取溫度對假蘋婆樹葉總黃酮得率的影響 由圖4可知,當提取溫度低于60 ℃時,總黃酮得率較低,溫度高于60 ℃時,總黃酮得率快速增大,70 ℃時達到最大。這是因為溫度升高之后,黃酮類化合物的滲透、擴散和溶解速度也進一步加快,有利于其溶出[18]。再升高溫度,得率有減小趨勢,這是因為在高溫下,熱穩(wěn)定性差的黃酮成分會發(fā)生降解,造成總黃酮得率減小,故選取70 ℃為適宜提取溫度。

圖4 提取溫度對假蘋婆總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of temperature on yield of the total flavonoids from the Sterculia lanceolata

2.1.5 料液比對假蘋婆樹葉總黃酮得率的影響 由圖5可知,料液比在1∶15～1∶25 (g/mL)之間時,假蘋婆總黃酮得率隨料液比的增大而緩慢增大,但整體得率相對較小,這是因為溶劑量過少,體系中溶出的黃酮類化合物與未溶出的黃酮類化合物濃度很快接近平衡,使總黃酮不能完全溶出。當料液比從1∶25 (g/mL)增加到1∶30 (g/mL)時,總黃酮得率明顯增大,繼續(xù)增加溶劑用量,總黃酮得率減小,考慮到溶劑量過多會增加下一步的濃縮時間,而且造成原料浪費,故選取1∶30 (g/mL)為適宜料液比。

圖5 料液比對假蘋婆總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ratio of raw material and liquid on yield of the total flavonoids from the Sterculia lanceolata

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素實驗結果,選擇乙醇體積分數(shù)、提取功率、提取時間、料液比4個因素按照表1設計L9(34)正交試驗,得到假蘋婆樹葉總黃酮得率,見表2。以下各個實驗均在最佳溫度70 ℃下進行。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of the orthogonal test

由表2、表3可知,各因素對總黃酮得率的影響大小順序為:乙醇體積分數(shù)>提取時間>料液比>提取功率,乙醇體積分數(shù)對假蘋婆總黃酮的提取影響極顯著,提取時間有顯著影響。假蘋婆總黃酮的最佳提取條件為A3B2C3D1,即乙醇體積分數(shù)為60%,提取功率為60 W,提取時間為65 min,料液比為1∶25 (g/mL)。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

為了進一步驗證最優(yōu)條件的可靠性,取上述最優(yōu)條件進行三次平行試驗,總黃酮得率為2.36%±0.0002%,提取率高于正交試驗中的任意結果,符合最優(yōu)條件。

2.3 回收率的測定

取1.0 mL最佳提取條件下得到的假蘋婆提取液6份,分別加入到10 mL比色管中,在各比色管中再分別加入1.0 mg蘆丁標準品,搖勻,靜置15 min后測定吸光度,得到平均回收率為99.49%,RSD=2%,表明該方法準確可靠。

2.4 假蘋婆樹葉總黃酮清除羥自由基的能力

羥自由基是最活潑的自由基,同時也是毒性最大的自由基,研究黃酮類化合物對羥自由基的清除具有一定意義[19]。由圖6可知,隨著假蘋婆樹葉總黃酮提取液和抗壞血酸質量濃度的增大,清除羥自由基的能力增強。和抗壞血酸相比,假蘋婆樹葉總黃酮提取液對羥自由基的清除能力相對較弱。但當假蘋婆樹葉總黃酮的質量濃度為4.92 mg/mL時,清除率達到73.58%。

圖6 假蘋婆樹葉總黃酮和抗壞血酸對羥自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of ascorbic acidtotal and flavonoids from Sterculia lanceolata at various concentrations on hydroxyl free radicals

3 結論

以假蘋婆樹葉為原料,采用超聲波輔助提取假蘋婆樹葉中的黃酮類化合物,通過單因素和正交試驗,得到較優(yōu)的提取工藝條件為:乙醇體積分數(shù)為60%,提取功率為60 W,料液比為1∶25 (g/mL),70 ℃下提取65 min,該條件下總黃酮得率為2.36%±0.0002%。總黃酮提取液對羥自由基的清除率隨著其濃度的增大而增大,當假蘋婆樹葉總黃酮的質量濃度為4.92 mg/mL時,清除率達到73.58%,表明假蘋婆總黃酮對羥自由基具有較好的清除效果。回收率實驗表明該方法準確可靠。