基于擠壓膨化的蠶豆醬成曲蛋白酶活力測定及其工藝優化

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(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122; 2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

蠶豆醬是以脫殼后的蠶豆為主要原料,與面粉混合后經制曲、發酵而制成的調味醬[1]。傳統蠶豆醬主要為家庭作坊式生產,面臨生產水平低、發酵周期長、加工期存在時限性、規模化程度低、質量不穩定等問題。因此,需采用科學的生產工藝,對蠶豆醬的生產工藝進行改進。擠壓膨化技術作為一種新型食品加工技術,為食品加工提供了新方法,為我國醬類生產傳統工藝的改進提供了一條新途徑[2]。采用擠壓膨化技術對原料進行預處理,與傳統的原料預處理方法相比,可省去蒸煮、殺菌等工序,有利于蛋白質適度變性、淀粉完全糊化,進而提高蛋白質和淀粉的利用率,縮短發酵周期[3-4],進而可提高生產效率和產品品質。采用擠壓膨化技術預處理原料制作蠶豆醬,卻尚未研究報道。

在蠶豆醬制作的過程中,需采用擠壓膨化技術預處理原料后進行制曲,然后發酵。制曲是醬制品釀造過程中的關鍵步驟,評價成曲質量的重要指標之一是蛋白酶活力的高低[5-6]。原料的預處理效果直接影響曲霉菌的生長情況,進而影響蛋白酶的分泌,從而影響蛋白酶的活力。本試驗采用擠壓膨化的預處理方式代替傳統蒸煮方法釀造蠶豆醬,而部分擠壓膨化工藝參數對蛋白質的變性程度有直接影響,具體包括:螺桿轉速、機筒末區溫度、物料水分含量等。因此,研究擠壓膨化參數對成曲酶活力的影響很有必要。

本研究采用擠壓膨化技術預處理蠶豆粉和面粉混合物,然后進行制曲,以成曲中的蛋白酶活力為指標,通過單因素試驗,研究擠壓膨化參數(螺桿轉速、面粉比例、機筒末區溫度、物料水分含量)對成曲蛋白酶活力的影響,并結合響應面試驗對擠壓膨化工藝進行優化,為擠壓膨化技術進一步用于蠶豆醬生產提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶豆粉 市購;面粉 香滿園優質特一小麥粉;曲精 上海迪發釀造生物制品有限公司;Folin試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 以上均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;酪蛋白標準品 純度92%,北京百靈威科技有限公司。

FMHE36-24型雙螺桿擠壓機 湖南富馬科食品工程技術有限公司;HH數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海柏欣儀器設備廠;Eppendorf-5804R型冷凍離心機 德國艾本德公司;AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RQH-150智能人工氣候培養箱 鄭州生元儀器有限公司;Waters600高效液相色譜儀 美國沃特斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠶豆醬的制作

1.2.1.1 擠壓膨化蠶豆粉和小麥粉混合物 稱取蛋豆粉500 g,按照一定的比例混合面粉,充分混合,置入喂料斗,并調節物料水分,物料經雙螺桿擠壓機在一定的螺桿轉速、一定的機筒末區溫度下進行擠壓膨化處理。傳統蒸煮法則是采用旋轉式蒸鍋加壓(0.2 MPa)蒸料。

1.2.1.2 膨化物制曲 待擠壓膨化產物冷卻到室溫后,接入0.5%曲精,與擠壓膨化物料混勻后放入30～35 ℃培養箱中培養48 h。

1.2.1.3 發酵方法 發酵采用低鹽固態發酵。將制好的成曲拌鹽水,控制鹽濃度為15%左右,醬醅含水量為50%,用保鮮膜封口。發酵溫度為35 ℃,發酵20 d,醬醅成熟,發酵結束。

1.2.2 單因素試驗 部分擠壓參數對蛋白質的變性程度有直接影響,包括螺桿轉速、機筒末區溫度、物料水分含量[7-8]。因此結合本試驗將蠶豆粉與面粉按比例混合，以中性蛋白酶活力為指標，選擇與擠壓直接相關的螺桿轉速(60、80、100、120、140 r/min)、面粉添加比例(10%、15%、20%、25%、30%)、機筒末區溫度(75、90、105、120、135℃)、物料水分含量(33%、38%、43%、48%、53%)4個實驗因素，分別進行單因素實驗，固定螺桿轉速120 r/min，面粉添加比例20%，機筒末區溫度120℃，物料水分含量43%。

1.2.3 響應面試驗 根據單因素實驗結果與分析,利用Design-Expert 8.0軟件進行響應面優化設計,以中性蛋白酶活力(Y1)為響應值,以螺桿轉速、面粉添加比例、機筒末區溫度、物料水分含量為因素進行響應面試驗。根據Box-Behnken中心組合設計原理設計試驗,試驗因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.3 指標測定

1.3.1 蛋白酶活力的測定 蠶豆醬生產工藝主要利用蛋白酶等酶系,其中主要為米曲霉產生的中性蛋白酶。以膨化物為原料得到的成曲中性蛋白酶活力用福林酚法測定,參照文獻[9]并稍作修改。

蛋白酶活力的定義:40 ℃,pH7.5條件下,1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量,定義為1個蛋白酶活力單位。

1.3.2 成曲中多肽分子量分布的測定 分別稱取蒸煮物料與擠壓膨化物料制曲后的成曲6 g于150 mL三角瓶內,加入95 mL pH7.2磷酸緩沖溶液,搖勻,在瓶口塞上橡皮塞后,55 ℃水浴2 h,拔下塞子,沸水浴中煮沸15 min。取出迅速冷卻至室溫,轉入100 mL容量瓶,定容至100 mL。10000 r/min離心15 min,吸取上清液,過0.45 μm水性微孔濾膜后進樣,進行多肽分子量分布的測定[10],測定條件:采用TSK gel 2000 SWXL型色譜柱,紫外檢測器,檢測波長為220 nm,流動相為乙腈/水/三氟乙酸=40/60/0.05,進樣體積為10 μL。

1.3.3 氨基酸態氮的測定 參照GB 5009.235-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》,測定蠶豆醬中的氨基酸態氮含量[11]。

1.3.4 水分含量的測定 參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》,測定蠶豆醬的水分含量[12]。

1.4 數據處理

實驗結果采用Origin和SPSS 18.0進行統計分析。

選取2016年3月—2018年3月進入本院接受治療的72例早期強直性脊柱炎骶髂關節病變患者作為此次實驗的研究對象，先后給予X線診斷、多層CT診斷及MRI診斷，其中男性患者42例（58.33%），女性患者30例（41.67%）；患者平均年齡為（57.45±2.62）歲；平均病長時間為（1.45±0.62）年；所有患者的性別、年齡和病長時間等基本資料對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。對X線診斷、多層CT診斷和MRI診斷實施后患者診斷的準確率進行比較。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 螺桿轉速對中性蛋白酶活力的影響 由圖1可知,中性蛋白酶活力隨著螺桿轉速的增加呈現出先升高后下降的趨勢,當螺桿轉速為120 r/min時,中性蛋白酶活力最高,為1300.6 U/g。當螺桿轉速低于120 r/min時,隨著螺桿轉速的增大,物料在擠壓機內的滯留時間縮短,而剪切力會隨之增大,且后者的作用大于前者,表現為物料的適度變性[13],有利于曲霉菌對營養物質的利用,有利于酶的生成,因此蛋白酶活力提高。當螺桿轉速超過120 r/min時,物料在擠壓機內的滯留時間極短,蛋白質變性程度降低,淀粉未能充分糊化,影響微生物對曲料營養物質的利用。因此,螺桿轉速可初步確定為120 r/min左右，故選擇110、120、130 r/min進行下一步的響應面優化實驗。

圖1 螺桿轉速對中性蛋白酶活力的影響Fig.1 Effects of screw speed on neutral protease activity

2.1.2 面粉添加比例對中性蛋白酶活力的影響 由圖2可知,當面粉添加比例為20%時,成曲中性蛋白酶活力最高,為1264.5 U/g。面粉在原料內部起到潤滑作用,當面粉含量過高時,剪切力下降,淀粉未能充分降解[14],從而影響成曲的質量,蛋白酶活力受影響;面粉含量過低時,小顆粒狀的蠶豆粉之間摩擦力增大,不易熔融,導致膨化物狀態不均勻[3],也會對成曲質量造成影響,使蛋白酶活力降低。因此,面粉添加比例可初步確定為20%左右，故選擇15%、18%、21%進行下一步的響應面優化實驗。

圖2 面粉添加比例對中性蛋白酶活力的影響Fig.2 Effects of wheat flour addition on neutral protease activity

2.1.3 機筒末區溫度對中性蛋白酶活力的影響 由圖3可知,成曲中性蛋白酶活力隨機筒末區溫度的升高而增加。當超過120 ℃時,中性蛋白酶活力提高程度隨溫度增加顯著,在機筒末區溫度為135 ℃時,中性蛋白酶活力最高,為1110.72 U/g。當機筒末區溫度低于120 ℃時,蛋白質不能達到完全變性[3],原料不能被菌體分泌的酶分解利用,從而造成中性蛋白酶活力降低。而機筒末區溫度過高,會使原料出現不可逆熱變性。因此,機筒末區溫度可初步確定為135 ℃左右?？紤]到135 ℃后中性蛋白酶活力有可能會繼續升高，因此將140 ℃納入響應面試驗范圍，故選擇110、125、140 ℃進行響應面試驗。

圖3 機筒末區溫度對中性蛋白酶活力的影響Fig.3 Effects of barrel temperature on neutral protease activity

2.1.4 物料水分含量對中性蛋白酶活力的影響 由圖4可知,隨著物料水分含量增加,中性蛋白酶活力呈現出先升高后降低的趨勢。當物料水分含量為43%時,中性蛋白酶活力最高,為1212.5 U/g。當物料水分含量增加時,擠壓膨化后的物料容易結塊,通透性變差,抑制了曲霉菌的生長,影響蛋白酶的分泌,導致蛋白酶活力降低[15]。另外,水分含量過高,會造成細菌等雜菌容易生長,生產安全性下降[16]。因此,物料水分含量可初步確定為43%左右，故選擇38%、43%、48%進行響應面試驗。

圖4 物料水分含量對中性蛋白酶活力的影響Fig.4 Effects of moisture content of ingredient on neutral protease activity

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立與分析 利用Design-Expert 8.0軟件進行Box-Behnken設計,以螺桿轉速、面粉添加比例、機筒末區溫度和物料水分含量為響應變量,以中性蛋白酶活力為響應值,進行響應面試驗,試驗設計及結果如表2所示。對表2中的數據進行多元二次回歸擬合,建立擠壓膨化工藝參數回歸模型?；貧w方程為:

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

Y=1342.03+23.25A-65.49B+61.66C+54.64D+67.79AB-72.27AC-3.89AD+10.41BC+85.76BD+3.38CD-44.63A2-132.31B2-130.11C2-227.36D2。

利用SAS9.1.3軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合,得到回歸模型并對其進行回歸方差分析及顯著性檢驗,結果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of varlances for the regression equation

2.2.2 響應面曲面交互作用分析 響應面圖形是響應值對各試驗因素A、B、C、D所構成的三維空間的曲面圖,從響應面分析圖上可以看出最佳參數及各參數之間的相互作用對響應值的影響。響應面坡度越陡峭,說明響應值對于操作條件的改變越為敏感,該因素對中性蛋白酶活力的影響越大[17-21]。等高線密集呈橢圓形,說明兩因素交互作用對響應值影響大;等高線呈圓形則說明影響不大。各因素交互作用對響應值的影響和等高線圖如圖5～圖10所示。在交互項對酶活力的影響中,螺桿轉速(A)和機筒末區溫度(C),面粉添加比例(B)和物料水分含量(D)之間交互作用顯著。

圖5 螺桿轉速與面粉添加比例對中性蛋白酶活力影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of screw speed and wheat flour addition on neutral protease activity

圖6 螺桿轉速與機筒末區溫度對中性蛋白酶活力影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of screw speed and barrel temperature on neutral protease activity

圖7 螺桿轉速與物料水分含量對中性蛋白酶活力影響的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of screw speed and moisture content of ingredient on neutral protease activity

圖8 面粉添加比例與機筒末區溫度對中性蛋白酶活力影響的響應面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of wheat flour addition and barrel temperature on neutral protease activity

圖9 面粉添加比例與物料水分含量對中性蛋白酶活力影響的響應面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of wheat flour addition and moisture content of ingredient on neutral protease activity

圖10 機筒末區溫度與物料水分含量對中性蛋白酶活力影響的響應面和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of barrel temperature and moisture content of ingredient on neutral protease activity

2.2.3 驗證試驗設計及結果 根據響應面試驗所得結果,利用軟件分析后,確定中性蛋白酶活力最大時的擠壓膨化參數為:螺桿轉速118.47 r/min、面粉添加比例17.45%、機筒末區溫度129.04 ℃、物料水分含量43.38%,此時,中性蛋白酶活力預測值為1358.89 U/g。為驗證模型可行性,考慮到實際情況,將最佳工藝條件修改為螺桿轉速120 r/min、面粉添加比例17%、機筒末區溫度130 ℃、物料水分含量45%,在此工藝條件下進行3組驗證試驗,并與傳統蒸煮法處理蠶豆粉和面粉混合物制曲后的中性蛋白酶活力進行對照。試驗得到的中性蛋白酶活力平均值為(1331.91±8.22) U/g,與預測值的誤差為2.03%,說明響應面法預測吻合度較高。而采用傳統蒸煮的方法處理蠶豆粉和面粉混合物后制曲,成曲中性蛋白酶活力為997.16 U/g,與對照相比,試驗組中性蛋白酶活力提高了33.57%。

2.3 兩種處理方式的蠶豆醬成曲多肽分子量分布

由圖11和表4可以看出,不同處理方式預處理原料制曲后的成曲多肽分子量分布變化顯著。表4中,Mp為峰尖分子量,擠壓處理物料制曲后的成曲小分子量肽的數量顯著增加。這表明擠壓預處理后物料的結構更適合于曲霉菌的生長,有利于蛋白酶的分泌,從而酶活較高,小分子肽數量增加。

圖11 擠壓膨化物料與蒸煮物料制曲后的成曲多肽分子量分布Fig.11 Peptide molecular weight distribution of koji in extrusion process and in cooking process

2.4 蠶豆醬釀造性能研究

在最優制曲條件下得到的蠶豆醬顏色呈紅褐色,有光澤,醬香較濃,無不良氣味,咸甜適口,稀稠適度。經檢測蠶豆醬的氨基酸態氮含量為0.720 g/100 g,水分為50.75%。

3 結論

本實驗得到的最佳擠壓工藝參數為:螺桿轉速為120 r/min,面粉添加比例為17%,機筒末端溫度為130 ℃,物料水分含量為45%,在此條件下,成曲中性蛋白酶活力為(1331.91±8.22) U/g。在最優制曲條件下得到的蠶豆醬氨基酸態氮含量為0.720 g/100 g,水分為50.75%,醬香較濃,稀稠適度。該結論可為傳統蠶豆醬工藝的升級提供有效的技術參數。