酶法提取地桃花多糖的工藝優化及其抗氧化活性

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(1.玉林師范學院生物與制藥學院,廣西玉林 537000; 2.廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室,廣西玉林 537000)

天然植物多糖具有抗炎、抗氧化[1]、增強免疫[2]、抗病毒[3]、防衰老[4]等多種藥理作用,且毒副作用低,越來越受到學者的重視[5]。植物多糖可作為食品和藥品的有效添加成分,藥食兩用植物多糖系列產品的市場前景將非常廣闊[6]。天然產物多糖來自于植物細胞膜和微生物細胞壁的天然高分子化合物,可采用有機溶劑、酶解等方法提取,其中酶解提取操作簡單、條件較溫和,在多糖結構研究以及活性保持方面具有一定的優勢[7]。

地桃花(UrenalobataL.)又稱肖梵天花、假桃花、野棉花等,屬于錦葵科植物,主要產于廣西、四川及貴州等地,富含多種藥效成分如多糖類、黃酮類、苷類、香豆素、木脂素以及蛋白質[8-10]。研究報道地桃花提取物具有明顯的抗炎、抗菌及抗氧化等藥理活性[11-13]。地桃花可清熱解毒、祛風利濕及活血消腫,用于治療感冒、痢疾等疾病,是中成藥花紅片生產的原料成分之一[14],對其有效成分多糖的研發將有助于提升其藥食兩用價值。目前有關地桃花單一成分提取及其生物活性的研究報道很少,針對多糖成分,僅見藍峻峰等采用超聲波輔助半仿生法提取,結果表明,在液料比30∶1、超聲功率60 W、提取溫度75 ℃、提取時間50 min的條件下,地桃花多糖得率為12.86%[14],此工藝相比酶法具有提取溫度高、需要超聲設備、工藝復雜等缺點。為了解地桃花多糖生物活性及優化其提取工藝,本文研究了纖維素酶提取地桃花多糖的最佳條件,并探討其體外抗氧化活性,為地桃花多糖進一步開發及抗氧化活性的深入研究提供一定的科技支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地桃花采自廣西容縣,經陳曉白教授鑒定為錦葵科梵天花屬地桃花干燥全草;纖維素酶(食品級,5萬U/g)、維生素C、D-無水葡萄糖 購自北京索萊寶科技有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 購自日本TCI公司;其它試劑 均為國產分析純。

5810R型高速離心機 德國Eppendorf;Alpha-1506型紫外分光光度計 上海譜元儀器;SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器 常州華普達教學儀器;PHS-25型pH計 上海雷磁;SHB-III型循環水真空泵、2L-ARE旋轉蒸發器 上海皓莊儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 地桃花多糖的提取 地桃花全草自然晾干,精確稱取5.0 g粉碎并過100目篩后的地桃花粉,按設定酶解條件(pH、液料比、酶添加量、酶解時間、酶解溫度),在180 r/min搖床上進行酶解提取實驗,得到多糖浸提液。多糖浸提液經90 ℃高溫滅活、6000 r/min離心分離10 min、抽濾、濾液用旋轉蒸發儀80 ℃濃縮至1/10、乙醇沉淀、Sevag法除蛋白、透析除雜、乙醇二次沉淀、真空冷凍干燥(溫度-55 ℃,壓力0.05 MPa)一系列步驟[15],最終獲得地桃花多糖。

1.2.2 地桃花多糖含量的測定 多糖測定采用苯酚-硫酸法[16],葡萄糖標準曲線方程為y=8.4986x-0.0185,R2=0.9903,式中y為490 nm條件下的吸光度值,x為葡萄糖質量濃度(mg/mL)。多糖得率計算公式如下:

多糖得率(%)=cnV/m×100

式中,c為樣品稀釋液中多糖的濃度(mg/mL),n為稀釋倍數,V為樣品稀釋液體積(mL),m為地桃花粉質量(mg)。

1.2.3 單因素實驗 酶解時搖床轉速固定為180 r/min,分別考察pH(3.0、4.0、5.0、6.0)、液料比(4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1 mL/g)、酶添加量(2、6、10、14、18 mg/mL)、酶解時間(40、80、120、160、200 min)和酶解溫度(35、45、55、65 ℃)對地桃花多糖得率的影響,其中各因素固定水平為pH5.0、液料比8∶1 mL/g、酶添加量10 mg/mL、酶解時間80 min、酶解溫度45 ℃。

1.2.4 響應面試驗 響應面因素水平設計見表1,自變量包括液料比、酶解時間、酶添加量、酶解溫度四個因素,以多糖得率為響應值。響應面試驗因素及水平表如表1所示。

表1 響應面因素設計與水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.5 地桃花多糖體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 取不同質量濃度的地桃花多糖溶液2 mL和2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)混勻,反應30 min后在517 nm處測定其吸光度A1,同法測定2.0 mL乙醇加樣液的吸光度A2,以及2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL蒸餾水的吸光度A0,以維生素C作為對照,樣品對DPPH自由基的清除率Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100[15]。

1.2.5.2 ·OH的清除能力測定 取不同質量濃度的地桃花多糖溶液2 mL,依次加入濃度均為5 mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液各2 mL,混勻,靜置10 min,再加入5 mmol/L的水楊酸溶液2 mL,混勻,37 ℃水浴30 min后,波長510 nm處測定吸光度B1,用蒸餾水代替水楊酸測定吸光度B2,以蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度B0,以維生素C作為對照,樣品對·OH的清除率Y(%)=[1-(B1-B2)/B0]×100[15-16]。

1.3 數據處理

所用數據是3次平行實驗的均值±標準差,響應面數據分析采用Design Expert 8.06軟件,采用 SPSS 20.0 進行數據間的顯著性分析,并利用GraphPad Prism 6.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 纖維素酶添加量對地桃花多糖得率的影響 由圖1可知,當酶添加量從2 mg/mL增加到10 mg/mL時,多糖得率顯著提高(p<0.05),由8.19%上升至12.78%,進一步加大酶用量,多糖得率沒有顯著變化(p>0.05),說明在該底物濃度下,酶濃度已經趨于飽和,繼續增加纖維素酶用量,對多糖得率沒有顯著影響(p>0.05)。因此,選擇10 mg/mL作為纖維素酶的最佳添加量。

圖1 纖維素酶添加量對多糖得率的影響Fig.1 Influence of cellulase dosage on the polysaccharide extraction rate注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),圖2～圖5同。

2.1.2 pH對地桃花多糖得率的影響 由圖2可知,當pH由3.0增加到5.0時,多糖得率由8.65%增加至最大值12.46%(p<0.05),pH增大到6.0時,多糖得率反而減小,得率為11.98%,與pH4.0、pH5.0比較差異均不顯著(p>0.05)。因為在最適pH時,酶分子上活性基團的解離狀態最適于與底物結合,pH高于或低于最適pH時,活性基團的解離狀態可能發生改變,酶和底物結合力減弱,酶反應速率降低。因此,酶解最適pH選定為5.0。

圖2 pH對多糖得率的影響Fig.2 Influence of pH value on the polysaccharide extraction rate

2.1.3 液料比對地桃花多糖得率的影響 由圖3可知,當液料比由4∶1增加到8∶1時,多糖得率由9.45%增加至13.25%(p<0.05),之后,隨著液料比繼續增大,多糖得率反而減小,原因可能與過高液料比不利于多糖物質溶出有關,此外,水用量過大加重后續濃縮工作負擔,不利于工業化實際生產。故液料比選擇為8∶1 mL/g。

圖3 液料比對多糖得率的影響 Fig.3 Influence of the ratio of water to material on the polysaccharide extraction rate

2.1.4 酶解溫度對地桃花多糖得率的影響 由圖4可知,溫度由35 ℃上升到45 ℃,多糖得率由9.35%增大至13.28%,主要因為溫度升高增強酶活性,促進有效成分溶出,55 ℃時多糖得率為13.07%,與45 ℃比較變化不顯著(p>0.05),進一步提高溫度至65 ℃,此時多糖得率顯著減小(p<0.05),這是因為溫度過高導致酶活力減弱所致。因此選擇45 ℃為最適酶解溫度。

圖4 酶解溫度對多糖得率的影響 Fig.4 Influence of hydrolysis temperature on the polysaccharide extraction rate

2.1.5 酶解時間對地桃花多糖得率的影響 由圖5可知,酶解40 min時多糖得率為8.65%,當時間延長至80 min時,多糖得率接近160 min時的最大值,再繼續延長提取時間,多糖得率變化不顯著(p>0.05),多糖提取效率反而降低,此外,酶解時間過長,酶催化活性減弱反而對多糖提取不利,考慮實際生產效率。因此,本研究選擇80 min為最佳酶解時間。

圖5 酶解時間對多糖得率的影響 Fig.5 Influence of hydrolysis time on the polysaccharide extraction rate

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗結果與分析 試驗設計及結果見表2,回歸模型方差分析見表3。對表2中數據進行回歸擬合,獲得自變量(液料比、酶解時間、酶添加量、酶解溫度)與地桃花多糖得率(Y)的二次多項回歸方程:

表2 地桃花多糖提取的響應面試驗結果Table 2 Results of response surface design for Urena lobata L. polysaccharides extraction

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

Y=12.98-0.36A-0.73B+0.82C-0.13D+1.67AB-0.27AC-0.18AD+0.83BC+1.26BD-1.17CD-1.37A2-1.86B2-1.35C2-1.42D2。

由表3的F值可知,地桃花多糖纖維素酶法提取影響因素的主次順序為:酶添加量(C)>酶解時間(B)>液料比(A)>酶解溫度(D),其中A影響極顯著(p<0.01),B、C影響顯著(p<0.05),D影響不顯著(p>0.05)。平方項A2、B2、C2、D2影響極顯著(p<0.01)。因素間交互作用對地桃花多糖得率的影響如圖6所示。由圖6(a、d、e、f)和表3方差分析結果可知,AB、BC、BD、CD交互作用對多糖得率影響達到極顯著水平(p<0.01),AC、AD間交互作用對多糖得率影響不顯著(p>0.05)。

圖6 各因素交互作用對多糖得率影響的響應面圖 Fig.6 Response surface graphs of effect of interactions of various factors on polysaccharide yield

2.2.2 最佳提取條件預測及驗證 對回歸模型方程求解,獲得地桃花多糖纖維素酶提取的最佳條件為液料比7.2∶1 mL/g,酶解溫度 43.2 ℃,酶解時間71.8 min,酶添加量10.74 mg/mL,此條件下多糖得率為13.37%。考慮實際操作方便,將上述最佳提取參數修改為液料比7∶1 mL/g,酶解溫度 43 ℃,酶解時間72 min,酶添加量10.8 mg/mL,根據工藝條件進行三組平行實驗,所得多糖得率為13.32%±1.15%,與回歸方程理論多糖得率13.37%的相對誤差為0.37%,提示本響應面法得到的回歸模型有效、可靠,得到的纖維素酶提取地桃花多糖工藝條件具有實際應用價值。

2.3 地桃花多糖的體外抗氧化活性

2.3.1 地桃花多糖對DPPH自由基的清除作用 由圖7可知,當地桃花多糖濃度在0.2～10 mg/mL時,對DPPH自由基清除率不斷增大,當質量濃度為10 mg/mL時,地桃花多糖對DPPH自由基清除率為90.06%,而維生素C對DPPH自由基清除率可達94.12%,地桃花多糖清除DPPH自由基的半數抑制濃度IC50為1.082 mg/mL,維生素C的IC50為0.643 mg/mL,兩者比較,地桃花多糖清除能力較弱于維生素C。以上結果提示地桃花多糖具有較好的DPPH自由基清除作用。

圖7 地桃花多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effect of polysaccharide from Urena lobata L. on DPPH radical

2.3.2 地桃花多糖對·OH清除作用 由圖8可知,當地桃花多糖濃度在0.2～10 mg/mL時,對·OH清除率穩步提升,而維生素C在濃度4 mg/mL時對·OH清除率就已達到最大值,之后趨于穩定。當質量濃度為10 mg/mL時,地桃花多糖對·OH清除率為89.75%,維生素C對·OH清除率可達96.38%,地桃花多糖清除·OH的IC50為3.202 mg/mL,維生素C的IC50為0.368 mg/mL,兩者比較,維生素C清除能力強于地桃花多糖。以上結果說明,地桃花多糖具有較好的·OH清除作用。

圖8 地桃花多糖對·OH的清除作用Fig.8 The scavenging effect of polysaccharide from Urena lobata L. on hydroxyl radical

3 討論與結論

本研究在單因素實驗基礎上,通過響應面優化試驗考察了地桃花多糖纖維素酶提取的工藝。結果發現,纖維素酶添加量對地桃花多糖得率影響最大,其次是酶解時間和液料比,而酶解溫度對其多糖提取影響最小;地桃花多糖最佳酶解提取條件為酶添加量10.8 mg/mL、酶解時間72 min、液料比7∶1 mL/g、酶解溫度43 ℃、pH=5.0,在此條件下地桃花多糖的得率為13.32%,與回歸模型方程預測值13.37%相比,相對誤差小于5%。藍峻峰等[14]探討超聲波法輔助半仿生法提取地桃花中多糖的最佳工藝,采用半仿生提取,在超聲波協同作用的基礎上,以正交試驗法考察超聲功率、超聲時間、超聲溫度等因素對多糖得率的影響,結果獲得地桃花多糖得率為12.86%,稍小于本研究中的多糖得率,本研究酶法提取溫度43 ℃明顯低于其提取溫度75 ℃,節約能源,且不需要大型設備,液料比明顯減小,可一定程度上提高生產效率。

體外抗氧化活性試驗表明,地桃花多糖對DPPH自由基、·OH均具有較強的清除能力,在本實驗質量濃度下,其對兩種自由基的清除能力均呈現一定的正相關關系。地桃花多糖清除DPPH自由基的IC50為1.082 mg/mL,清除·OH的IC50為3.202 mg/mL。但與維生素C比較,地桃花多糖清除兩種自由基的能力較弱。薛井中等也研究地桃花水提取物清除·OH和DPPH自由基、及抑制油脂氧化的能力,結果表明地桃花提取物各部位均有一定的抗氧化能力,但抗氧化活性都弱于維生素C[17],與本研究結果一致。以上結果為地桃花功能成分的研究開發提供一定的前期理論基礎。