美拉德反應(yīng)法制備臘肉香精的工藝優(yōu)化

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(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010)

美拉德反應(yīng)能賦予食品愉快的香味和誘人的色澤,是生產(chǎn)肉味香精的主要反應(yīng)[1]。肉制品經(jīng)酶解后,可得到具有一定功能的多肽和氨基酸的混合物。以酶解液為基料,通過美拉德反應(yīng)得到的肉味香精肉香濃郁、香氣逼真,并具有較好的熱穩(wěn)定性[2]。美拉德反應(yīng)制得的肉香味香精迎合了人們對食品肉香味的喜愛,滿足了食品生產(chǎn)企業(yè)在增香調(diào)味方面的需求,因而成為了調(diào)味料領(lǐng)域發(fā)展極快的新型調(diào)味料[3-4]。

肉味香精是國際上70年代發(fā)展起來的一類新型食用香精,人們對合成和天然肉味香精都進(jìn)行了較廣泛的研究[5]。現(xiàn)在對于肉類香精的研制,肉味前體物質(zhì)、復(fù)雜的反應(yīng)機(jī)理及影響反應(yīng)的因素等方面的研究已取得了許多成果[6],美拉德反應(yīng)制備香精產(chǎn)物與反應(yīng)起始pH、溫度、時間等有重要關(guān)系,也與參與反應(yīng)的糖(包括單糖、寡糖和多糖)、氨基酸等有很大關(guān)系[2],張富縣等[7]比較了葡萄糖與木糖在豬肉香精美拉德反應(yīng)中對香氣的影響,結(jié)果表明,木糖對香氣的肉味貢獻(xiàn)大,葡萄糖對香氣的焦香貢獻(xiàn)大,若同時使用葡萄糖和木糖,香氣更豐滿;Karangwa等[8]研究了溫度和半胱氨酸添加量對向日葵水解產(chǎn)物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物形成的影響。通過美拉德反應(yīng)也制備出了鴨肉、牛肉、豬肉、雞肉香精等肉味香精,安廣杰等[9]以雞骨架酶解液為原料,通過美拉德反應(yīng)制備雞肉味香精,得到制備雞肉味香精的各因素最佳水平組合,即當(dāng)木糖添加量為2.50%,反應(yīng)pH為8,反應(yīng)溫度為120 ℃,反應(yīng)時間為25 min時,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有優(yōu)良的雞肉香精風(fēng)味。張穎[10]以鴨肉為原料,研究了鴨肉香精工藝及其微膠囊化工藝,結(jié)果表明,鴨肉香精制備最佳工藝條件為熱反應(yīng)時間79.80 min,熱反應(yīng)溫度118.5 ℃,pH5.2,木糖添加量9.50%,L-半胱氨酸鹽酸鹽添加2.50%。

目前,對于制備具有抗氧化活性的臘肉香精的相關(guān)研究還是空白,因此,本文以川味臘肉酶解液作為實(shí)驗(yàn)基料,以感官評價為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察不同還原糖種類及配比、不同氨基酸、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度及起始pH對美拉德反應(yīng)法制備臘肉香精的影響;以感官評價和DPPH自由基清除率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn),得到美拉德反應(yīng)法制備臘肉香精的最優(yōu)工藝,制備具有肉香特征和抗氧化性的臘肉香精。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬背脊肉 綿陽八品農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司;磷酸二氫鈉(AR)、D-木糖(BR)、無水葡萄糖(AR)、L-蛋氨酸(BR)、L-精氨酸(BR)、L-絲氨酸(BR)、L-丙氨酸(BR)、鹽酸硫胺素(維生素B1,BR) 成都市科龍化工試劑廠;L-谷氨酸BR,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、無水乙醇 分析純,成都市科龍化工試劑廠;中性蛋白酶(酶活力200000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(酶活力15000 U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司。

PHS-3CB型pH計 上海越平科學(xué)儀器有限公司;BS223S型電子天平 德國賽多利斯公司(北京);HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;SZ-1型快速混勻器 常州普天儀器制造有限公司;G20-PHOH 電磁爐 上海奔騰企業(yè)有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(油浴鍋) 河南省予華儀器有限公司;UV1000紫外-可見光分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司;美國布林克曼煙熏爐;真空腌味機(jī) 深圳市瑞豐電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臘肉制作流程與預(yù)處理 將豬背脊肉切成厚度為4～6 cm約重250 g的肉條,備用[11];稱取豬背脊肉重量5%的鹽涂抹于備用肉條上,涂抹均勻后放入真空腌味機(jī)里,轉(zhuǎn)動25～30 min 以促進(jìn)鹽的吸收,之后將肉條在4 ℃左右腌制24 h[11-12]。將上述腌制好的肉條懸掛進(jìn)煙熏爐,用柏枝為柴火,利用其不完全燃燒釋放出的植物油脂青煙對肉條進(jìn)行熏烤,直至肉條表面微微起焦、呈金黃色時,取出掛于通風(fēng)處自然風(fēng)干72 h,進(jìn)行后熟[13]。

取出臘肉條并用刀刮除肉表面焦黑部分,再用蒸餾水沖洗干凈后用刀削片,切成3 mm×3 mm肉末備用[13]。

1.2.2 臘肉酶解液的制備 前期通過臘肉酶解工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[13],得到最佳工藝,即稱取100.00 g備用臘肉肉末,加入1∶2 g/mL的蒸餾水,加酶量為0.35%(臘肉質(zhì)量比),中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶按1∶2比例進(jìn)行配比,在自然pH,47 ℃水浴,酶解5 h后,在100 ℃水浴滅酶15 min后離心過濾,取濾液備用。

1.2.3 臘肉香精的制備 將制備好的臘肉酶解液置于具塞試管中,準(zhǔn)確稱取并加入氨基酸、還原糖等原料,用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH,塞緊試管塞,放入油浴鍋,在一定溫度下反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后迅速取出,冰水浴冷卻備用。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 不同還原糖種類及配比對臘肉香精制備的影響 取七份等量臘肉酶解液,加入0.20% L-半胱氨酸,0.20%鹽酸硫胺素(維生素B1),再分別加入4%的葡萄糖、木糖、葡萄糖+木糖(G+X)(質(zhì)量比1∶2、1∶3、1∶1、2∶1、3∶1),不調(diào)pH,在110 ℃油浴鍋中反應(yīng)40 min,取樣,備用待測。

1.2.4.2 不同氨基酸對臘肉香精制備的影響 取八份等量臘肉酶解液,加入4% G+X(3∶1),0.20%鹽酸硫胺素,再分別加入0.20% L-半胱氨酸、L-丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、L-蛋氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸及不加氨基酸,不調(diào)pH,在110 ℃油浴鍋中反應(yīng)40 min,取樣,備用待測。

1.2.4.3 不同反應(yīng)時間對臘肉香精制備的影響 取六份等量臘肉酶解液,加入4% G+X(3∶1)、0.20% L-半胱氨酸,0.20%鹽酸硫胺素,不調(diào)pH,在110 ℃分別反應(yīng)20、40、60、80、100、120 min,取樣,備用待測。

1.2.4.4 不同反應(yīng)溫度對臘肉香精制備的影響 取六份等量臘肉酶解液,加入4% G+X(3∶1)、0.20% L-半胱氨酸,0.20%鹽酸硫胺素,分別在100、105、110、115、120、125 ℃反應(yīng)40 min,取樣,備用待測。

1.2.4.5 不同起始pH對臘肉香精制備的影響 取六份等量臘肉酶解液,加入4% G+X(3∶1)、0.20% L-半胱氨酸,0.20%鹽酸硫胺素,分別調(diào)節(jié)pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,原始pH(5.8～5.9),在110 ℃油浴鍋中反應(yīng)40 min,取樣,備用待測。

1.2.4.6 不同鹽酸硫胺素添加量對臘肉香精制備的影響 取七份等量臘肉酶解液,鹽酸硫胺素添加量分別為0、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%,再加入4% G+X(3∶1)、0.20% L-半胱氨酸,在110 ℃油浴鍋中反應(yīng)40 min,取樣,備用待測。

1.2.5 臘肉香精的正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以九點(diǎn)快速感官評分和DPPH自由基清除率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),采用L18(37)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計,分別選取G+X(3∶1)添加量、L-半胱氨酸添加量、鹽酸硫胺素添加量、反應(yīng)時間以及反應(yīng)溫度五個因素的三個水平,正交試驗(yàn)的因素水平如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.6 感官評定方法

1.2.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)感官評定方法 采用排序檢驗(yàn)法,即比較數(shù)個樣品,按指定的特性由強(qiáng)度或嗜好程度排序的方法。對樣品按指定特性(色澤(黃-棕色)、臘肉香氣、澄清度)根據(jù)強(qiáng)度、嗜好程度或整個印象對樣品排序,使用Friedman排序檢驗(yàn)法[14]對顯著性差異進(jìn)行判斷。感官評定小組男女比例為1∶1的10名食品相關(guān)專業(yè)人員組成。

1.2.6.2 正交試驗(yàn)感官評定方法 采用9點(diǎn)快感標(biāo)度檢驗(yàn)法,評定員對每個樣品的總體接受性按照9點(diǎn)快感標(biāo)度檢驗(yàn)法評分,即1-非常不喜歡、2-很不喜歡、3-不喜歡、4-有點(diǎn)不喜歡、5-既不喜歡也不討厭、6-有點(diǎn)喜歡、7-喜歡、8-很喜歡、9-非常喜歡。感官評定小組由10名食品相關(guān)專業(yè)人員組成[15]。

1.2.7 DPPH自由基清除能力的測定 根據(jù)Sun等[16]的方法略作修改。取1.2.3所得樣液,用蒸餾水稀釋20倍后,取2.00 mL于試管中,加入0.20 mmol/L的DPPH溶液2.00 mL,混合均勻,置于暗處反應(yīng)30 min,在517 nm處測定其吸光值A(chǔ)i;同時測定2.00 mL樣液加入2.00 mL無水乙醇暗處反應(yīng)30 min的吸光值A(chǔ)j;以及2.00 mL無水乙醇加2.00 mL DPPH在暗處反應(yīng)30 min后的吸光值A(chǔ)0;平行三次實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0、Nonparametic Test和Excel對各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同種類及配比還原糖對臘肉香精制備的影響 美拉德反應(yīng)主要是由氨基化合物和還原糖或其它羰基化合物發(fā)生的反應(yīng),還原糖的種類在反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用,還原糖因種類和配比不同,對美拉德反應(yīng)物的感官影響也不同[17]。由表2可知,Friedman檢驗(yàn)得到F=15.43,p=0.017<0.05,在0.05水平上,七個樣品存在顯著差異,G樣品的秩和高,風(fēng)味最佳,即G+X(3∶1);其次是E樣品和F樣品,再次是C、B、D樣品,最差的是A樣品,即只有葡萄糖。吳爽[18]以谷朊粉酶解物為原料,通過美拉德反應(yīng)制備肉味香精,發(fā)現(xiàn)只有葡萄糖時,反應(yīng)速率相對較慢,葡萄糖與木糖按比例混合加入后,反應(yīng)速率變快,且肉香味強(qiáng)烈,最后按葡萄糖與木糖比例3∶1的比例進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn),與本文結(jié)論相似。綜合考慮,選用的還原糖為G+X(3∶1)。

表2 不同種類及配比還原糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價秩和Table 2 Sensory evaluation rank sum of Milliard reaction product with different reducing sugar types and proportions

2.1.2 不同種類氨基酸對臘肉香精制備的影響 氨基和羰基在一定條件下發(fā)生美拉德反應(yīng),氨基酸是美拉德反應(yīng)重要氨基來源之一,不同氨基酸體系對美拉德反應(yīng)物的感官影響也不同。在形成肉香的過程中,含硫氨基酸和一些脂肪族氨基酸都起了重要作用[19]。選擇幾種可能有利于肉類風(fēng)味形成和增加抗氧化性的氨基酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3所示,由Friedman檢驗(yàn)得到F=35.32,p=0.0001<0.05,在0.05顯著水平上,八個樣品存在顯著差異,A樣品的秩和高,風(fēng)味最佳,即添加L-半胱氨酸的感官評價效果最好;其次是G樣品和H樣品,再次是C、F、B樣品,最差的是D和E樣品。L-半胱氨酸是含硫氨基酸,含硫氨基酸形成的各種含硫雜環(huán)化合物對肉香的形成有極其重要的作用[20]。綜合考慮,選用的氨基酸為L-半胱氨酸。

表3 不同種類氨基酸的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價秩和Table 3 Sensory evaluation rank sum of Milliard reaction product with different amino acids types

2.1.3 不同反應(yīng)時間對臘肉香精制備的影響 由表4可知,Friedman檢驗(yàn)得到F=13.33,p=0.02<0.05,在0.05顯著水平上,六個樣品存在顯著差異,B樣品感官評價的秩和最大,即在40 min時,反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味最佳。隨著反應(yīng)時間的延長,反應(yīng)產(chǎn)物的色澤越趨于黑色,褐變程度加強(qiáng),感官秩和值下降。鄒利[21]用豬骨粉酶解液制備肉味香精,發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加,反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度逐漸加強(qiáng),在60～80 min,生成的中間體量逐漸下降,生成的香味中間體可能參與了類黑精的生成反應(yīng)。與本文研究結(jié)果相似。綜合考慮,選取反應(yīng)時間20、40、60 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表4 不同反應(yīng)時間的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價秩和Table 4 Sensory evaluation rank sum of Milliard reaction product with different reaction time

2.1.4 不同反應(yīng)溫度對臘肉香精制備的影響 在一定溫度范圍內(nèi),隨著溫度的增加,肉味香精的風(fēng)味物質(zhì)也隨著增加,但在反應(yīng)過程中溫度過高,還原糖發(fā)生焦糖化反應(yīng)生產(chǎn)黑褐色物質(zhì),影響反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味和色澤[22]。由表5可知,Friedman檢驗(yàn),得到F=27.89,p=0.0001<0.05,在0.05顯著水平上,六個樣品存在顯著差異,C樣品,即110 ℃時樣品風(fēng)味最佳,之后隨著溫度增加,反應(yīng)產(chǎn)物褐變越快,感官值降低。研究表明[18],在100～120 ℃之間,產(chǎn)物主要為肉香味;劉紅等[23]用鰱魚蛋白酶解液制備肉味香精,反應(yīng)體系溫度在110 ℃時,產(chǎn)物風(fēng)味最好,有鹵汁味與肉香味,整體香氣協(xié)調(diào),與本文結(jié)果相似。綜合考慮,選取反應(yīng)溫度為105、110、115 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表5 不同反應(yīng)溫度的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價秩和Table 5 Sensory evaluation rank sum of Milliard reaction product at different reaction temperature

2.1.5 不同起始pH對臘肉香精制備的影響 在美拉德反應(yīng)中,pH是反應(yīng)的重要影響因素之一,直接影響美拉德反應(yīng)進(jìn)程[24-25]。由表6可知,Friedman檢驗(yàn)得到F=28.58,p=0.0001<0.05,在0.05顯著水平上,七個樣品存在顯著差異,隨著pH的增加,樣品感官評價的秩次和先增加后減小。C樣品,即pH為6時秩次和最高,同時G樣品,即原始pH(5.8～5.9)與C樣品(pH為6)的秩次和差別不大,都具有較好的風(fēng)味。吳爽[18]研究了起始pH對谷朊粉酶解物制備肉味香精的影響,結(jié)果表明,在0.05顯著水平上,pH為5、6、7、8的四個樣品間存在顯著差異,選擇的反應(yīng)初始pH為6.0,與本文結(jié)果相似。綜合考慮,pH選取原始pH(5.8～5.9),即不調(diào)pH。

表6 不同起始pH的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價秩和Table 6 Sensory evaluation rank sum of Milliard reaction product with different initial pH

2.1.6 不同鹽酸硫胺素添加量對臘肉香精制備的影響 鹽酸硫胺素在美拉德反應(yīng)制備香精過程中能形成許多重要的肉類風(fēng)味貢獻(xiàn)產(chǎn)物,因此常作為重要的反應(yīng)前體物質(zhì)[19]。

由表7可知,隨著鹽酸硫胺素添加量的增加,感官評價的秩和呈先增加后減小的趨勢,E樣品感官風(fēng)味最佳,其次是F樣品,再者為D和G樣品。鄒利[21]在用豬骨粉酶解液制備肉味香精時,得出反應(yīng)的最佳組合中鹽酸硫胺素添加量為0.20%。綜合考慮,選擇0.20%、0.30%、0.40%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表7 不同鹽酸硫胺素添加量的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評價秩和Table 7 Sensory evaluation rank sum of Milliard reaction product with different thiamine hydrochloride

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表8可知,根據(jù)極差分析法[14]計算,F空列和G空列的Re值分別為0.2、0.25,A、B、C、D、E各因素極差R值分別為1.90、2.12、1.18、1.72和1.40均大于Re值,說明試驗(yàn)具有可靠性。A、B、C、D、E五個因素對感官評分的影響大小排序?yàn)锽>A>D>E>C,即L-半胱氨酸添加量影響最大,其次是還原糖添加量,然后依次為反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、鹽酸硫銨素添加量。

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of orthogonal experiment

同理,計算DPPH自由基清除率各列的極差R,F空列和G空列的Re值分別為0.11、0.22,A、B、C、D、E各因素極差Rj值分別為0.95、1.07、1.36、2.16和1.75均大于Re值,具有可靠性。各因素影響順序?yàn)镈>E>C>B>A,即反應(yīng)時間影響最大,其次是溫度,然后依次是鹽酸硫銨素(維生素B1)添加量、L-半胱氨酸添加量、還原糖添加量。與感官指標(biāo)分析相比,反應(yīng)溫度與時間影響程度變大。說明在本研究中,對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官影響較大的是G+X(3∶1)添加量和L-半胱氨酸添加量,而對抗氧化性有較大影響的是反應(yīng)溫度和時間,可能是在美拉德反應(yīng)中,隨著時間及溫度的增加,具有抗氧化性的產(chǎn)物如類黑精等物質(zhì)也在增多;當(dāng)時間與溫度變化范圍較小時,對感官的影響程度可能略小于其他因素。

此外,分析表8中k值可知,對于指標(biāo)感官評分,A2B1C2D2E2為最佳實(shí)驗(yàn)組合;對于指標(biāo)DPPH自由基清除率A3B3C3D3E3為最佳實(shí)驗(yàn)組合,但考慮到相同因素中DPPH自由基清除率的k值差異較小,因此綜合考慮,按照各因素感官評分的最優(yōu)水平選取組合A2B1C2D2E2,即還原糖(G+X 3∶1)添加量為4%、L-半胱氨酸添加量為0.10%、鹽酸硫銨素添加量為0.30%、反應(yīng)時間為40 min、反應(yīng)溫度為110 ℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到的臘肉香精,具有飽滿的臘肉香味,其感官評分為8.3±0.5,DPPH清除率達(dá)到86.37%±0.51%,有較強(qiáng)的抗氧化性。

3 結(jié)論

為制備具有抗氧化性的臘肉香精,通過感官評價中的排序檢驗(yàn)法,確定選用的氨基酸為L-半胱氨酸,還原糖為G+X(3∶1)(葡萄糖和木糖質(zhì)量比為3∶1),原始pH。采用L18(37)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計,用九點(diǎn)快感標(biāo)度檢驗(yàn)法和DPPH自由基清除能力檢測,得出臘肉香精制備的最優(yōu)工藝為G+X(3∶1)添加量為4%、L-半胱氨酸添加量為0.10%、鹽酸硫銨素添加量為0.30%、反應(yīng)時間為40 min、反應(yīng)溫度為110 ℃。在此條件下得到的臘肉香精,具有飽滿的臘肉香味,感官評分為8.3±0.5,DPPH自由基清除率達(dá)到86.37%±0.51%,有較強(qiáng)的抗氧化性。