不同殼聚糖脫乙酰度測定方法的適宜性研究

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(1.西南科技大學,四川省生物質資源利用與改性工程技術研究中心,四川綿陽 621010; 2.綿陽師范學院,四川綿陽 621006)

殼聚糖是經甲殼素脫色、脫乙酰基后制備的天然生物大分子,是一種堿性、帶有正電荷的由N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖組成的無分支二元多聚糖。由于其良好的安全性、成膜性、生物可降解性、生物相容性而被廣泛用作功能食品、食品添加劑、果蔬保鮮劑、飲料澄清劑[1-2],醫療上可作藥物載體、抗菌劑[3-4],同時可用于農業、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化等諸多領域[5-7]。殼聚糖脫乙酰度值的大小直接影響其粘度、溶解能力、離子交換能力、免疫活性、絮凝性能、膜的伸張性大小和氨基有關的化學反應能力等性質及開發應用[8]。因此,脫乙酰度是決定殼聚糖特定生理活性的重要參數之一,更是殼聚糖產品質量判定的一個主要指標。

現有的殼聚糖脫乙酰度測定方法較多,如紅外光譜法、紫外光譜法、色譜法、線性電位滴定法、雙突躍電位滴定法、酸堿滴定法、核磁共振法、庫倫滴定法、元素分析法等,這些方法各有優劣,有的需要專門的儀器,所需成本高,但測定結果較準確,有的方法簡單,操作方便,但測定精度較差[9-14]。同時,課題組研究發現，殼聚糖的來源、粘度、分子量等因素對測定方法的選擇有較大影響,因此尋求一種簡便快速、精密準確、成本低廉、通用性高的分析方法成為分析工作者研究殼聚糖脫乙酰度測定的目標。

本文首先比較了改良后的酸堿滴定法、線性電位滴定法、雙突躍電位滴定法、膠體滴定法、紫外光譜法、紅外光譜法六種常用測定方法,并對測定方法進行優化,繼而采用不同來源與不同性質的殼聚糖考察優選方法的普適性,以期確定不同殼聚糖脫乙酰度測定方法的適用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖(標示脫乙酰度:95.5%;分子量50000、100000;粘度76、60 mPa·s) 浙江金殼藥業有限公司;高粘度殼聚糖(>400 mPa·s) Sigma公司;蜣螂、土元、蟬蛻 成都荷花池藥材市場;濃鹽酸、氫氧化鈉、甲基橙、亞甲基藍、甲苯胺藍、高錳酸鉀等試劑(均為分析純)、溴化鉀(優級純)、聚乙烯硫酸鉀溶液 和光純藥工業株式會社;N-乙酰-D-氨基葡萄糖 阿拉丁試劑。

HJ-4磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;PHS-3E型pH計 上海精科雷磁儀器廠;FA1104電子天平 上海精科;Alpha-1500紫外可見分光光度計 上海譜元儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 改良酸堿滴定法 對于酸堿滴定法:精密稱取標示脫乙酰度為95.5%的殼聚糖樣品0.5 g,加0.1 mol/L HCl標準溶液30 mL,置磁力攪拌器上攪拌至完全溶解,加入2～3滴甲基橙指示劑,溶液變為紅色,用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定變成橙色,即為終點。實驗顯示,滴定終點不易判斷,于是將甲基橙指示劑換為甲基橙-亞甲基藍[15-16],則滴定時溶液由紫色變為淡綠色,便于觀察,即為改良酸堿滴定法。記錄消耗NaOH用量,用式(1)、式(2)計算脫乙酰度(DD)。

式(1)

式(2)

式中:C1,鹽酸標準溶液的濃度(mol/L);C2,氫氧化鈉標準溶液的濃度(mol/L);V1,加入的鹽酸標準溶液的體積(mL);V2,滴定耗用的氫氧化鈉標準溶液的體積(mL);G,樣品重(g);W,樣品的水分(%);0.016,與1 mL 1 mol/L的鹽酸溶液相當的氨基量;9.94%,理論氨基含量。

1.2.2 雙突躍電位滴定法 精密稱取0.2 g干燥至恒重的標示脫乙酰度為95.5%的殼聚糖樣品,置于50 mL燒杯中,加入20 mL 0.1 mol/L HCl標準溶液,室溫下磁力攪拌使其完全溶解,再加入30 mL蒸餾水。將pH電極放入樣品溶液中,用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定,記錄原pH及加入不同體積NaOH標準溶液后被滴定液的pH,以溶液的pH對NaOH標準溶液滴定體積作圖,即得到酸堿滴定曲線,做pH對VNaOH的一級微商曲線,得到雙突躍滴定曲線[17],按式(3)計算殼聚糖脫乙酰度。

式(3)

式中:n=C×(V2-V1);C,NaOH的濃度(mol/L);V1,第一突躍點時用去的NaOH標準溶液的體積(L);V2,第二突躍點時用去的NaOH標準溶液的體積(L);G,樣品重(g)。

1.2.3 線性電位滴定法 精密稱取標示脫乙酰度為95.5%的0.25 g殼聚糖,加入0.1 mol/L的HCl 20 mL,于磁力攪拌器上攪拌至殼聚糖完全溶解。加入10 mL蒸餾水,攪拌均勻,加入2～3滴甲基橙指示劑,攪拌均勻。用0.1 mol/L NaOH滴定,前2～4 mL NaOH滴加后,不記錄pH,以后每滴加1 mL NaOH,攪拌均勻后,記錄甲基橙指示劑變為黃色前的4個pH,將每個pH對應的氫氧化鈉溶液的體積(v)代入函數式(4)。

式(4)

式中:f(v),電位滴定時,體積與電位的函數關系;V0,鹽酸標準溶液的體積加上稀釋用蒸餾水的體積(mL);V,氫氧化鈉標準溶液的體積(mL);NB,氫氧化鈉標準溶液的濃度(mol/L);[H+],H+的濃度(mol/L);[OH-],OH-的濃度(mol/L)。

計算f(v),以f(v)為縱坐標,V為橫坐標作圖,以直線外推與橫坐標相交點的橫坐標值為所用的氫氧化鈉標準溶液的體積(Ve),按式(5)計算殼聚糖的脫乙酰度[18]。

式(5)

式中:C1,鹽酸標準溶液的濃度(mol/L);C2,氫氧化鈉標準溶液的濃度(mol/L);V1,加入的鹽酸標準溶液的體積(mL);m,樣品重(mg);161,殼聚糖中氨基葡萄糖的鏈節分子量。

表1 改良后的酸堿滴定法測定結果Table 1 Results of improved acid-base titration

式(6)

式中:NPVSK,PVSK的當量濃度(g/L);M殼,殼聚糖的鏈節分子量161.15;ΔV,消耗PVSK的體積差V1-V2(L);C,殼聚糖溶液的濃度(g/mL)。

1.2.5 紫外光譜法 以0.001 mol/L HCl為溶劑,用0.1 mg/mL N-乙酰葡萄糖胺配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的標準溶液,以0.001 mol/L HCl為參比液,在203 nm處測定系列溶液的吸光度,繪制標準曲線。

稱20 mg標示脫乙酰度為95.5%的殼聚糖樣品于100 mL量瓶中,加入10 mL 0.01 mol/L鹽酸溶解后,用去離子水稀釋至刻度,搖勻,以0.01 mol/L鹽酸作為參比液,測定其在203 nm處的吸光度,從工作曲線中得到樣品中乙酰基的濃度[20],按式(7)計算脫乙酰度。

式(7)

式中:C乙酰基,樣品中乙酰基的濃度(mg/mL);C樣,殼聚糖樣品濃度(mg/mL)。

式(8)

1.2.7 自制殼聚糖的制備 將蜣螂、土鱉蟲、蟬蛻分別粉碎,取適量,加入1.3 mol/L HCl進行脫礦,繼而加入4 mol/L NaOH溶液脫蛋白,收集殘渣,去離子水洗至中性,50 ℃干燥12 h后先后加入3%高錳酸鉀溶液與2%草酸溶液進行脫色,而后加入20 mol/L的NaOH溶液脫乙酰,50 ℃干燥12 h即得自制殼聚糖[22]。

1.2.8 通用性檢測 通過比較上述幾種脫乙酰度測定方法,篩選出準確度與精密度較高的方法,分別以高分子量(150000)、低分子量殼聚糖(50000)、高粘度(400 mPa·s)、中粘度(200 mPa·s)、低粘度殼聚糖(60 mPa·s)、自制殼聚糖為考察對象,進行通用性檢測,從而考察不同測定方法對不同分子量、不同粘度、不同來源殼聚糖的適用性。

1.3 數據處理

每種方法做3次平行,結果取平均值±標準偏差,以樣品標示脫乙酰度為真實值,精密度以相對標準偏差來衡量,準確度的計算如式(9)、式(10)、式(11)所示。

偏差=|脫乙酰度計算值-樣品標示脫乙酰度|

式(9)

式(10)

式(11)

2 結果與分析

2.1 改良酸堿滴定法

由表2可知:市購殼聚糖的脫乙酰度為98.35%,相對標準偏差RSD為0.33%。以標示值為殼聚糖真實值,計算得準確度為97.01%。利用殼聚糖的自由氨基呈堿性,可與酸定量的發生質子化反應,形成殼聚糖的膠體溶液,以指示劑顏色變化為判定依據,確定滴定終點,得堿消耗量,使用甲基橙-亞甲基藍指示劑進行滴定,改善了單用甲基橙作為指示劑的顯色反應不明顯的問題,提高了實驗的可重復性。

2.2 雙突躍電位滴定法

從圖1、圖2可知,用NaOH標準溶液滴定殼聚糖時,明顯存在兩個滴定突躍點,第一個突躍點范圍在pH為2～4之間,第二個滴定突躍的范圍在pH為6～8之間。前一突躍對應NaOH中和溶液中過量HCl的過程,后一突躍對應NaOH中和質子化胺基的過程,反映滴定終點前后的情況。計算得殼聚糖脫乙酰度為76.92%,相對標準偏差為0.28%,該結果與殼聚糖脫乙酰度標示值相差較大,準確度僅為80.55%,其原因可能是當樣品溶液滴定至弱酸性時,殼聚糖沉淀逐漸析出,并粘附于玻璃電極的膜表面,導致溶液越來越渾濁與粘稠,從而嚴重干擾電極對溶液H+活度的響應,影響測定,同時延長了測定時間[23]。

圖1 殼聚糖脫乙酰度的滴定曲線Fig.1 Titration curve of deacetylation degree of chitosan

圖2 一級微商曲線Fig.2 First-order derivative curve

2.3 線性電位滴定法

由表2所得數據,以f(v)為縱坐標,滴定消耗NaOH溶液V(mL)為橫坐標作圖,如圖3,回歸方程為:y=-2.3168x+14.988,R2=0.9994,表明線性關系良好,以直線外推與橫坐標相交點的橫坐標值為所用的氫氧化鈉標準溶液的體積,結果如表3所示。

表2 線性電位滴定法的V-f(V)Table 2 V-f(V)of linear potentiometric titration

表3 線性電位滴定法測定結果Table 3 Results of linear potentiometric titration

表4 膠體滴定法測定結果Table 4 Results of colloidal titration

圖3 線性電位滴定法滴定曲線Fig.3 Linear potentiometric titration curve

計算得樣品的脫乙酰度為87.35%,相對標準偏差為0.48%。由測定結果可知，線性電位滴定法準確度較高,重復性好,其原因是線性電位滴定法只需測定滴定終點前的4～5組數據,繪圖外推即可得到滴定終點時所消耗的氫氧化鈉用量,避免析出的殼聚糖干擾測定,影響滴定終點的判斷,減少了因確定終點而引起的誤差。

2.4 膠體滴定法

實驗結果顯示:殼聚糖脫乙酰度為84.15%,相對標準偏差RSD為2.36%。由結果可知，該方法的計算偏差較大,該方法易受到指示劑用量、溶液pH、滴定速度與離子強度等因素的影響[24],指示劑滴加過多,待測溶液變為深藍色,當滴定至理論終點,溶液變色不明顯,滴定終點判斷滯后,造成測定偏差,滴定速度受氫離子電力速度限制,滴定過快,正負離子間來不及締合,滴定的PVSK與指示劑作用變色,導致滴定終點判斷提前,滴定過慢,溶液出現返色,均導致測定結果出現較大誤差。

2.5 紫外光譜法

以等梯度濃度的N-乙酰-D-氨基葡萄糖溶液在203 nm處的吸光度(A)與濃度(mg/mL)繪制標準曲線,得回歸方程為y=13.51x,R2=0.9975,表明線性關系良好。計算得到殼聚糖脫乙酰度為88.34%,相對標準偏差為0.66%,由表5可知測得的脫乙酰度值較真實值偏低,主要原因是D-氨基葡萄糖在203 nm處影響N-乙酰基-D-葡萄糖胺溶液吸光度的測定,使得吸光度偏大,樣品中乙酰基濃度偏大,測得脫乙酰度偏低,另外,樣品中含有的少量不溶性雜質也影響測定[24]。

表5 紫外光譜法測定結果Table 5 Results of UV spectroscopy

2.6 紅外光譜法

樣品的紅外光譜如圖4。

圖4 殼聚糖紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of chitosan

計算得到樣品的脫乙酰度為80.22%,與真實值相差較大,準確度為85.75%,相對標準偏差為1.86%,由于不同脫乙酰度,殼聚糖分子中酰胺基團參與形成的鏈內、鏈間氫鍵的數目均不同,酰胺峰的位置也將受到影響,且該方法對殼聚糖樣品處理的要求較高,樣品處理的好壞直接影響到測定結果,導致該方法可重復性低,操作難度大,技術要求高,需要特殊儀器。

2.7 六種方法的綜合評價

從測定方法的準確度、精密度、簡便性、耗時幾方面對其進行綜合評價,如表6所示。

表6 不同測定方法綜合評價Table 6 Comprehensive evaluation of different measurement methods

結果顯示:改良酸堿滴定法測定殼聚糖脫乙酰度,操作簡單,不需特殊儀器,準確度與精密度高;雙突躍滴定法取點多,接近終點時,析出的殼聚糖可影響pH及時準確的測定,滴定耗時長,操作繁瑣,測定準確度較低;線性電位滴定法在滴定時取點少,較雙突躍滴定方便省時;膠體滴定法對滴定速度控制嚴格,速度過快,不利于正負電荷的締合反應,速度過慢,溶液有返色現象;紅外光譜法、紫外光譜法均需要特殊儀器,其中紅外光譜法操作步驟簡單,但對實驗人員的技能要求較高,而紫外光譜法測定脫乙酰度影響因素少,測定值客觀準確,精密度較好,測定時所需樣品量少,但測定對照用標準品價格較高。綜上,改良酸堿滴定法、線性電位滴定法、紫外光譜法的測定準確度、精密度均較高。

2.8 通用性

針對不同來源、不同分子量、不同粘度的殼聚糖,對優選的改良酸堿滴定法、線性電位滴定法、紫外光譜法三種方法的通用性進行考察,結果如表7所示。

表7 不同殼聚糖脫乙酰度測定結果Table 7 Results of degree of deacetylation of different chitosan

由表7可知,上述三種方法通用性均較好,適用于大部分不同類型的殼聚糖。因低分子量(≤100000)的殼聚糖溶解后為黃色,滴加指示劑后溶液顏色受殼聚糖顏色影響,無法判定滴定終點,故無法采用酸堿滴定法及線性電位滴定法,應采用紫外光譜法,而高粘度(≥400 mPa·s)的殼聚糖脫乙酰度測定可采用線性電位滴定法,其余殼聚糖脫乙酰度測定均可使用改良后的酸堿滴定法,測定結果準確、精密度高,且所需儀器簡單、成本低。

3 結論

紅外光譜法對儀器和樣品處理要求高,雙突躍電位滴定法耗時長,膠體滴定法重現性差,且上述三種方法準確度較低,故非脫乙酰度測定的優選方法,而改良酸堿滴定法、線性電位滴定法、紫外光譜法的精密度與準確度均較高,且從通用性考察來看,改良酸堿滴定法、線性電位滴定法、紫外光譜法的通用性均較好,綜合考慮,改良酸堿滴定法測定結果準確、精密度高,且所需儀器簡單、成本低,是脫乙酰度測定的優選法,但該方法不能測定低分子量、高粘度殼聚糖,對于低分子量(≤100000)殼聚糖脫乙酰度的測定建議采用紫外光譜法,而高粘度(≥400 mPa·s)殼聚糖脫乙酰度的測定可采用線性電位滴定法。