貯藏條件對赤霞珠葡萄汁活性成分含量及抗氧化能力的影響

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(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

紅葡萄汁富含多種營養物質,如碳水化合物、有機酸、維生素、礦物質元素等[1],同時,還含有大量的多酚[2]、花色苷[3]、白藜蘆醇[4]和黃酮[5]等活性物質。研究表明，紅葡萄汁具有多種生物學特性,可以有效清除自由基,具有抗氧化[6-8]、抗炎[9-10]、保肝[11]、預防癌癥[12]和抗輻射[13]等生理功效。葡萄汁中的酚類物質不穩定,易受加工和貯藏過程中一些理化因素如pH、氧氣、光照、溫度等影響,發生降解。韓博等[14]發現，在低溫環境(4 ℃)和常溫環境(25 ℃)下,濃縮葡萄汁的多酚、黃酮、花青素等成分以及抗氧化活性隨貯藏時間的增加均出現下降趨勢。李維新等[15]研究發現，不同貯藏條件下,刺葡萄酒在貯藏期間黃酮類物質逐漸降低,低溫下貯藏可以減緩游離花色苷、原花青素、總類黃酮含量的下降。馬麗艷等[16]采用HPLC方法研究貯藏條件(貯藏溫度、光照)對葡萄酒中四種白藜蘆醇異構體含量的影響,發現高溫貯藏不利于葡萄酒中白藜蘆醇的保存,商業流通中的燈光照射對葡萄酒中白藜蘆醇含量無明顯影響。可見，控制葡萄汁貯藏中活性成分含量的損失對提高葡萄汁產品質量，延長貨架期具有重要意義。

因此,本文以赤霞珠葡萄汁為試驗材料,研究貯藏溫度(4、10、25 ℃)和光照方式(自然光、日光燈、避光)對其活性成分含量和抗氧化能力的影響,為葡萄汁加工和貯藏過程中質量控制提供理論依據和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄 采摘于新疆五家渠農業科學院葡萄種植基地,無病蟲害及腐爛果,可溶性固形物含量為24%±2.0%；白藜蘆醇標品(>98%) 上海生工生物工程有限公司;沒食子酸標品(>98%) 上海永葉生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、乙腈和甲酸(色譜純) 美國Sigma公司;抗壞血酸(>99%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、鹽酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、冰乙酸、氫氧化鈉、福林酚、無水碳酸鈉、氯化鉀、無水乙酸鈉(分析純) 天津盛通泰化工化學試劑有限公司;果膠酶(10000 U/mL)、纖維素酶(700 U/mL)、β-葡聚糖酶(5000 U/mL) 天津諾維信生物技術有限公司。

BCD-229BSV型冰箱 青島海爾集團有限公司;MCR-3型微電腦微波化學反應器 上海恬恒儀器有限公司;FA2104N型分析天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;YP2002型電子天平 上海越平科學儀器有限公司;FE20型pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;TGL-16G型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋 北京永光明醫療儀器有限公司;TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;LC-16型高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄汁的制備 赤霞珠葡萄清洗、除梗、破碎,按照果膠酶∶纖維素酶∶β-葡聚糖酶=2∶1∶1(V∶V∶V)的配比,添加1.4%(m/V)的復合酶,置于4 ℃冰箱中酶解8 h,稱取75 g葡萄漿液(汁液與皮渣質量比為3∶1),在-18 ℃冰箱中冷凍處理16 h后,取出放在微波功率為450 W的微波化學反應器中處理40 s,最后在8000 r/min的條件下離心20 min,得到可溶性固形物為28%的葡萄汁。將葡萄汁裝于50 mL醫用無菌PET瓶中密封包裝。

1.2.2 貯藏試驗設計 葡萄汁隨機分6組,每組10瓶,不同溫度和光照條件下貯藏40 d,每隔4 d取一次樣,測定活性成分含量和抗氧化能力。

溫度條件:在同一室內自然光(白天自然光照射,夜晚無燈光照射)下,選擇4、15、25 ℃三個溫度條件;

光照條件:在同一室溫(平均溫度(20±2) ℃)下,選擇自然光、日光燈持續照射、避光三個光照條件。

1.2.3 活性成分含量的測定

1.2.3.1 花色苷含量的測定 采用pH示差法,參照楊兆艷[17]的方法略作改動。取葡萄汁1.0 mL,分別用pH1.0和pH4.5的緩沖溶液定容至10.0 mL,置于暗處反應1 h,用蒸餾水做空白,在520、700 nm處測定吸光值,根據公式計算出花色苷含量。

式中,A為(A520 nmpH1.00-A700 nmpH1.00)-(A520 nmpH4.50-A700 nmpH4.50);MW為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子量,449.2;DF為稀釋因子;ε為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數,26900;L為光程,1 cm;W為葡萄質量,g。

1.2.3.2 多酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteus法[18],以沒食子酸濃度為橫坐標,765 nm處吸光值為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=0.00142x-0.00684,R2=0.9992。取250 μL葡萄汁,加入蒸餾水12.5 mL、福林肖卡顯色劑1.25 mL,20%碳酸鈉溶液5.0 mL,顯色1.5 h后測定吸光值,將吸光值帶入標準曲線,得到多酚的含量。

1.2.3.3 白藜蘆醇含量的測定 HPLC條件[4]:Pgrandsil-STC-C18柱(4.6×250 mm,5 μm),進樣量20 μL,流速1.0 mL/min,檢測波長306 nm,柱溫35 ℃,流動相:A為0.2%的乙酸,B為純乙腈,20%的B等度洗脫30 min;以白藜蘆醇質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=13443.71457x+135.38191,R2=0.9995;葡萄汁經0.45 μm濾膜過濾后直接上機分析。將峰面積帶入標準曲線,得到白藜蘆醇的含量。

1.2.4 抗氧化能力的測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力 參考Alvarez-Jubete等[19]方法略作改動。用無水乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液,吸取DPPH溶液2.0 mL分別與不同濃度的抗壞血酸標準溶液2.0 mL混勻,室溫避光放置30 min,用無水乙醇調零,在517 nm波長處測定吸光值。以VC濃度(2～12 μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=-0.05907x+1.11621,r=-0.9991。吸取樣品待測液2.0 mL,按照制作標準曲線方法測定,結果用VC當量表示。

1.2.4.2 羥自由基清除能力 參考Bi等[20]方法略作改動。取10 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0 mL,加入10 mmol/L水楊酸溶液1.0 mL,分別加入不同濃度的抗壞血酸標準溶液1.0 mL,最后加入8.8 mmol/L過氧化氫溶液1.0 mL啟動反應,搖勻后在37 ℃條件下反應30 min,用蒸餾水調零,在510 nm波長處測定吸光值。以VC濃度(0.1～0.5 mg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=-2.72463x+1.52515,r=-0.9994。吸取樣品待測液1.0 mL,按照制作標準曲線方法測定,結果用VC當量表示。

1.2.4.3 超氧陰離子抑制能力 參考羅春麗等[21]方法略作改動,取pH8.2的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL,置于25 ℃水浴中預熱20 min,分別加入不同濃度的抗壞血酸標準溶液1.0 mL,加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL,混勻后放入25 ℃水浴反應5 min,最后加入8 mol/L鹽酸溶液1.0 mL終止反應,用蒸餾水調零,在299 nm波長處測定吸光值。以VC濃度(0.05～0.45 mg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=-5.09782x+2.17724,r=-0.9993。吸取樣品待測液1.0 mL,按照制作標準曲線方法測定,結果用VC當量表示。

1.2.4.4 鐵的還原能力 參考Lu等[22]方法略作改動,取不同濃度的抗壞血酸標準溶液1.0 mL,加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)1.0 mL和1.0%的鐵氰化鉀溶液1.0 mL,將混合液于50 ℃溫浴20 min,急速冷卻后,加入10%的三氯乙酸溶液1.0 mL終止反應,最后加入蒸餾水2.0 mL和0.1%的三氯化鐵溶液0.4 mL顯色,在700 nm波長處測定吸光值。以VC濃度(0.01～0.05 mg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=23.26847x+0.00232,r=0.9997。吸取樣品待測液1.0 mL,按照制作標準曲線方法測定,結果用VC當量表示。

1.3 數據處理

采用Excel 2003對實驗數據進行整理后,應用統計分析軟件SPSS 20.0對數據進行顯著性和相關性分析,利用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 貯藏過程中葡萄汁活性成分含量的變化

2.1.1 貯藏過程中花色苷含量的變化 由圖1a可知,隨著貯藏時間的增加,不同溫度下的葡萄汁中花色苷含量呈下降的趨勢,處理組間存在顯著性差異(p<0.05)。4 ℃下貯藏40 d的葡萄汁中花色苷含量為318.165 mg/L,保留率為43.61%。隨貯藏溫度的升高,葡萄汁中花色苷含量逐漸減少,10 ℃下貯藏的葡萄汁中花色苷含量從最初的729.496 mg/L下降到第40 d的292.651 mg/L,保留率為40.12%,25 ℃下貯藏40 d的葡萄汁中花色苷含量保留率為38.81%,當貯藏溫度升高時,葡萄汁中的花色苷會逐漸生成無色的查爾酮,導致花色苷的褪色和降解[23]。

由圖1b可知,不同光照方式下的葡萄汁中花色苷含量隨貯藏時間的增加均呈顯著下降的趨勢(p<0.05)。避光下貯藏的葡萄汁中花色苷含量明顯高于其他組,在第40 d的花色苷含量為331.582 mg/100 mL,保留率最大為45.45%,日光燈照射下貯藏40 d的葡萄汁中花色苷含量保留率為43.42%,自然光照下貯藏的葡萄汁中花色苷含量隨貯藏時間的增加減少的較快,從最初的729.496 mg/L下降到第40 d的262.024 mg/L,保留率為35.92%,葡萄汁中的花色苷在光照條件下會發生酰基脫落,導致花色苷的含量下降[24]。

圖1 貯藏溫度(a)與光照方式(b)對葡萄汁花色苷含量的影響Fig.1 Effects of storage temperature(a)and illumination(b) on anthocyanins pigment contents in grape juice

2.1.2 貯藏過程中多酚含量的變化 由圖2a可知,隨貯藏時間的增加,不同溫度下的葡萄汁中多酚含量均呈顯著下降的趨勢(p<0.05)。貯藏期間,25 ℃下貯藏的葡萄汁中多酚含量從最初的2430.719 mg/L下降到第40 d的1229.793 mg/L,保留率為50.59%,10 ℃下貯藏40 d的葡萄汁中多酚含量為1334.753 mg/L,保留率為54.91%,4 ℃下貯藏的葡萄汁多酚含量在貯藏期間減少的較為緩慢,第40 d的多酚含量為1419.078 mg/L,保留率為58.38%,這是因為，低溫可以抑制酚氧化酶的活性,降低葡萄汁中酚類物質的氧化、縮合及降解[25]。

圖2 貯藏溫度(a)與光照方式(b)對葡萄汁多酚含量的影響Fig.2 Effects of storage temperature(a) and illumination(b)on polyphenols contents in grape juice

由圖2b可知,隨貯藏時間的增加,不同光照方式下的葡萄汁中多酚含量均呈下降的趨勢,處理組間均有顯著性差異(p<0.05)。貯藏期間,自然光照下的葡萄汁多酚含量從最初的2430.719 mg/L下降到第40 d的1281.705 mg/L,保留率為52.73%,日光燈照射下貯藏40 d的葡萄汁中多酚含量為1376.168 mg/L,避光下貯藏40 d的葡萄汁中多酚含量為1459.850 mg/L,保留率為60.06%,說明避光條件可以較好地延緩酚類化合物的降解。

2.1.3 貯藏過程中白藜蘆醇含量的變化 由圖3a可知,不同溫度下的葡萄汁隨貯藏時間的增加白藜蘆醇含量呈下降的趨勢,處理組間均有顯著性差異(p<0.05)。4、10、25 ℃下貯藏40 d的葡萄汁中白藜蘆醇含量分別為1.474、1.188、1.087 mg/100 mL,分別減少了63.01%、70.19%、72.72%,升高貯藏溫度對白藜蘆醇影響比較明顯,持續的高溫會造成葡萄汁中白藜蘆醇的氧化、聚合以及糖基化反應的發生[26]。

由圖3b可知,不同光照方式下的葡萄汁中白藜蘆醇含量隨貯藏時間的增加呈下降的趨勢,處理組間均有顯著性差異(p<0.05)。自然光照、日光燈照射、避光下貯藏40 d的葡萄汁中白藜蘆醇含量分別為1.253、1.351、1.495 mg/100 mL,分別減少了68.56%、66.10%、62.48%,光照下白藜蘆醇易發生轉化或降解反應[26],促進向糖苷化轉變的趨勢,自然光照組比日光燈照射組表現得更加明顯。

圖3 貯藏溫度(a)與光照方式(b)對葡萄汁白藜蘆醇含量的影響Fig.3 Effects of storage temperature(a) and illumination(b)on resveratrol contents in grape juice

2.2 貯藏過程中葡萄汁的抗氧化能力分析

2.2.1 貯藏過程中DPPH自由基清除能力的變化 由圖4a可知,隨貯藏時間的增加,不同溫度下的葡萄汁對DPPH自由基清除能力呈下降的趨勢,同一貯藏時間,4、10 ℃組的葡萄汁對DPPH自由基清除能力均顯著高于25 ℃組(p<0.05)。4、10 ℃下貯藏到第40 d的葡萄汁對DPPH自由基清除能力的保留率分別為94.62%和91.74%,其中4 ℃貯藏40 d的葡萄汁對DPPH自由基清除能力為67.505 μg/mL,25 ℃下貯藏的葡萄汁對DPPH自由基清除能力從最初的71.343 μg/mL下降到第40 d的63.912 μg/mL,保留率為89.58%,高溫貯藏會造成葡萄汁中的天然抗氧化成分減少,抗氧化能力逐漸減弱,DPPH自由基清除能力逐漸降低[27]。

由圖4b可知,不同光照方式下的葡萄汁對DPPH自由基清除能力隨貯藏時間的增加呈下降的趨勢,同一貯藏時間,避光組的葡萄汁對DPPH自由基清除能力均顯著高于自然光照和日光燈照射組(p<0.05)。第40 d避光下的葡萄汁對DPPH自由基清除能力為64.553 μg/mL,保留率為90.48%,自然光和日光燈照射下的葡萄汁對DPPH自由基清除能力的保留率分別為87.04%和89.94%。

圖4 貯藏溫度(a)與光照方式(b)的對葡萄汁DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effects of storage temperature(a)and illumination(b) on the scavenging ability of DPPH free radical of grape juice

2.2.2 貯藏過程中羥自由基清除能力的變化 由圖5a可知,不同溫度下的葡萄汁對羥自由基清除能力隨貯藏時間的增加呈顯著下降的趨勢(p<0.05)。4、10 ℃下貯藏到第40 d的葡萄汁對羥自由基清除能力分別為2.073、1.973 mg/mL,保留率分別為89.66%和85.34%,25 ℃下貯藏到第40 d的葡萄汁對羥自由基清除能力的保留率為84.60%,高溫貯藏會加速活性成分的損失,抗氧化能力會隨之減弱,羥自由基清除能力逐漸降低。

由圖5b可知,隨貯藏時間的增加,不同光照方式下的葡萄汁對羥自由基清除能力呈下降的趨勢,避光下的葡萄汁對羥自由基清除能力顯著高于其他組(p<0.05),貯藏到第40 d的葡萄汁對羥自由基清除能力為2.036 mg/mL,自然光和日光燈照射下貯藏到第40 d的葡萄汁對羥自由基清除能力分別為2.007、2.030 mg/mL,不同光照方式對葡萄汁中花色苷等酚類物質有明顯的作用,會直接影響羥自由基清除能力。

圖5 貯藏溫度(a)與光照方式(b)對葡萄汁羥自由基清除能力的影響Fig.5 Effects of storage temperature(a) and illumination(b) on the scavenging ability of hydroxyl radical of grape juice

2.2.3 貯藏過程中超氧陰離子抑制能力的變化 由圖6a可知,隨貯藏時間的增加,不同溫度下的葡萄汁對超氧陰離子抑制能力呈下降的趨勢,處理組間均有顯著性差異(p<0.05)。4 ℃下貯藏到第40 d的葡萄汁對超氧陰離子抑制能力為1.066 mg/mL,分別是10、25 ℃組的1.01和1.10倍,與10、25 ℃相比,4 ℃下貯藏有利于葡萄汁對超氧陰離子抑制能力的保持,顯著延緩了貯藏期間超氧陰離子抑制能力的下降。隨貯藏時間的增加,溫度越高，超氧陰離子抑制能力越弱,與王麗芳等[28]研究貯藏溫度對雙孢蘑菇抗氧化活性的變化趨勢一致。

由圖6b可知,在不同光照方式下的葡萄汁對超氧陰離子抑制能力隨貯藏時間的增加呈顯著下降的趨勢(p<0.05)。避光下貯藏第40 d的葡萄汁對超氧陰離子抑制能力為1.074 mg/mL,保留率最大為92.75%,自然光和日光燈照射下的葡萄汁對超氧陰離子抑制能力從最初的1.158 mg/mL,分別下降到第40 d的0.980、1.027 mg/mL,保留率分別為84.63%和88.69%,長時間光照會破壞葡萄汁中的酚類物質結構,使其發生氧化生成小分子的醛酮類化合物,從而失去具有抑制自由基能力的活性物質。

圖6 貯藏溫度(a)與光照方式(b)對葡萄汁超氧陰離子抑制能力的影響Fig.6 Effects of storage temperature(a)and illumination(b) on the scavenging ability of superoxide anion of grape juice

2.2.4 貯藏過程中鐵的還原能力的變化 由圖7a可知,不同溫度下的葡萄汁隨貯藏時間的增加對鐵的還原能力呈下降的趨勢,處理組間均有顯著性差異(p<0.05)。4 ℃下貯藏40 d的葡萄汁對鐵的還原能力從最初的0.233 mg/mL下降到0.188 mg/mL,保留率為80.69%,10 ℃下貯藏40 d的葡萄汁對鐵的還原能力為0.182 mg/mL,保留率為78.11%,25 ℃下貯藏40 d的葡萄汁對鐵的還原能力為0.176 mg/mL,保留率為75.54%,整個貯藏期間,相比10 ℃和25 ℃，4 ℃貯藏的葡萄汁對鐵的還原能力的損失較少,25 ℃下貯藏的葡萄汁對鐵的還原能力損失較多。

圖7 貯藏溫度(a)與光照方式(b)對葡萄汁鐵的還原能力的影響Fig.7 Effects of storage temperature(a) and illumination(b)on the reduction ability of grape juice

由圖7b可知,不同光照方式下的葡萄汁對還原能力隨貯藏時間的增加呈下降的趨勢,處理組間均有顯著性差異(p<0.05)。光照處理組與避光組相比,葡萄汁中鐵的還原能力損失的比較多,整個貯藏期間,光照處理組的葡萄汁對鐵的還原能力顯著低于避光組(p<0.05),避光下貯藏40 d的葡萄汁對鐵的還原能力從最初的0.233 mg/mL下降到0.189 mg/mL,保留率為81.12%,自然光和日光燈照射下貯藏40 d的葡萄汁對鐵的還原能力分別為0.181、0.187 mg/mL,保留率分別為77.68%和80.28%,光照會造成葡萄汁中活性成分發生降解反應,導致鐵的還原能力的下降[29]。

2.3 花色苷含量與抗氧化活性的相關性分析

從表1可以看出,不同貯藏條件的葡萄汁中花色苷含量與抗氧化活性的相關性差異較大，且均為正相關。10、25 ℃下貯藏的葡萄汁中花色苷含量與各抗氧化指標均呈極顯著正相關(p<0.01)。4 ℃下貯藏的葡萄汁中花色苷含量與DPPH自由基、超氧陰離子的抑制能力和鐵的還原能力均呈極顯著正相關(p<0.01),與羥自由基清除能力相關性不顯著(p>0.05)。

表1 葡萄汁貯藏過程中花色苷含量與抗氧化成分的相關性Table 1 Correlation between anthocyanin content and antioxidant ingredient in grape juice during storage

自然光照下貯藏的葡萄汁中花色苷含量與DPPH自由基、超氧陰離子的抑制能力和鐵的還原能力均呈極顯著正相關(p<0.01),與羥自由基清除能力呈顯著正相關(p<0.05)。日光燈照射下貯藏的葡萄汁中花色苷含量與DPPH自由基清除能力和鐵的還原能力呈極顯著正相關(p<0.01),與超氧陰離子的抑制能力呈顯著正相關(p<0.05),與羥自由基清除能力相關性不顯著(p>0.05)。避光下貯藏的葡萄汁中花色苷含量與DPPH自由基清除能力和鐵的還原能力呈極顯著正相關(p<0.01),與羥自由基、超氧陰離子的抑制能力呈顯著正相關(p<0.05)。由此可知，葡萄汁中花色苷含量與其抗氧化活性之間密切相關,王行等[30]研究發現，貯藏條件對藍莓汁酚類物質及抗氧化活性有影響,酚類物質可以有效清除自由基。

3 結論

不同的貯藏條件對葡萄汁的活性成分含量和抗氧化能力均有顯著性的影響(p<0.05)。4 ℃較10 ℃和25 ℃下貯藏能更好地保持葡萄汁中的活性物質含量和維持抗氧化能力。4 ℃下貯藏的葡萄汁中花色苷、多酚和白藜蘆醇含量分別為318.165、1419.078 mg/L和1.474 mg/100 mL,對DPPH自由基、羥自由基清除能力為67.505 μg/mL、2.073 mg/mL,對超氧陰離子抑制能力為1.066 mg/mL,對鐵的還原能力為0.188 mg/mL。

避光比自然光和日光燈照射下貯藏更能有效延緩活性物質含量的減少,最大限度地保持抗氧化能力。避光下貯藏的葡萄汁中花色苷、多酚和白藜蘆醇含量分別為331.582、1459.850 mg/L和1.495 mg/100 mL,對DPPH、羥自由基清除能力為64.553 μg/mL、2.036 mg/mL,對超氧陰離子抑制能力為1.074 mg/mL,對鐵的還原能力為0.189 mg/mL。

貯藏期間,4 ℃或避光下的葡萄汁活性成分比其他組保存的較好,25 ℃或自然光照下的葡萄汁在貯藏后期易發酵,營養物質易分解,化學性質易發生改變,穩定性和抗氧化活性較差。說明4 ℃或避光條件下貯藏能有效減緩葡萄汁活性成分的損失,延長其產品的貯藏期,是葡萄汁較適宜的貯藏條件。