低分子量瓜爾豆膠水解物對昆明小鼠便秘的預(yù)防作用

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(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院,北京 100083; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;3.北京瓜爾潤科技股份有限公司,北京 100020)

近年來,隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變及精神心理和社會因素等的影響,便秘已成為現(xiàn)代人生活的常見疾病。據(jù)流行病學(xué)研究顯示:我國總體便秘患病率為3%～11%;且患病率隨著年齡的增長顯著升高,60歲以上老年人患病率為15%～20%;而80歲以上人群患病率可達(dá)20%～37%[1]。長期便秘與糖尿病、結(jié)直腸癌、心腦血管等疾病密切相關(guān),嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。因此,便秘已成為亟待解決的公共健康問題[2]。

引起便秘的原因很多,飲食結(jié)構(gòu)不合理是便秘產(chǎn)生的主要原因。近年來,隨著生活水平的提高,精細(xì)加工的高蛋白、高脂肪、高碳水化合物的食物已成為人們的飲食主體,而這些食物中的維生素、礦物質(zhì)、纖維素等營養(yǎng)成分含量較低。研究表明,飲食中缺乏膳食纖維是導(dǎo)致便秘形成的重要原因[3]。膳食纖維參與機(jī)體內(nèi)許多重要生理功能,如改善便秘、調(diào)節(jié)腸道菌群等[4-5]。這是由于膳食纖維具有蓄水的性質(zhì),它在腸內(nèi)吸收水分后膨脹,使糞便柔軟脹大,增加糞便量和縮短其腸內(nèi)滯留時(shí)間而改善便秘。此外膳食纖維還可以調(diào)節(jié)腸道菌群,促進(jìn)益生菌的增殖,產(chǎn)生短鏈脂肪酸;抑制腸道有害菌群生長,減少其代謝產(chǎn)物的堆積和吸收[6]。

目前,根據(jù)是否能溶于水將膳食纖維分為可溶性膳食纖維和不可溶性膳食纖維。瓜爾豆膠是一種常用的增稠劑,同時(shí)也是一種可溶性膳食纖維,據(jù)報(bào)道瓜爾豆膠具有潤腸通便、緩解結(jié)腸癌等功效[7-8]。而瓜爾豆膠水解物(partially hydrolyzed guar gum,PHGG)具有水溶性、非凝膠及低黏度特性,且膳食纖維含量高達(dá)90%左右[9];能夠提高慢性便秘患者的結(jié)腸傳輸時(shí)間及緩解慢性便秘患者病癥的功效[10];提高健康人體的排便頻率和糞便重量、提高糞便含水率、降低血清膽固醇、降低糞便pH并且能夠有效緩解腸道易激綜合征的癥狀[11-13]。低分子量瓜爾豆膠(low molecular weight partially hydrolyzed guar gum)是按照Li等[11]方法從瓜爾豆膠水解物中分離所得的分子量較低的組分,平均分子量為2.5×104Da,寡糖(聚合度<7)含量占24.9%,總膳食纖維含量高達(dá)90.6%。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)表明低分子瓜爾豆膠水解物的益生元屬性優(yōu)于瓜爾豆膠水解物;且其對小鼠便秘的干預(yù)作用尚未見報(bào)道。

本文通過復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生便秘,從小腸推進(jìn)率、首粒黑便排出時(shí)間、6 h糞便濕重及個(gè)數(shù)、血清因子水平、小腸HE染色和糞便中有機(jī)酸含量7個(gè)方面系統(tǒng)地研究L-PHGG對昆明小鼠的便秘預(yù)防作用,為L-PHGG的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明小鼠 北京維通利華動物技術(shù)有限公司,許可證號為:SCXK(京)2016-0011;普通維持飼料(含碳水化合物50%、脂肪10%、蛋白質(zhì)20%) 北京科奧協(xié)力飼料有限公司,許可證號為:SCXK(京)2014-0010;復(fù)方地芬諾酯 北京利華開順貿(mào)易有限公司;比沙可啶、HE染料(伊紅和蘇木素) 美國Sigma試劑公司;L-PHGG 北京瓜爾潤股份有限公司;血清因子試劑盒包括胃動素(motilin,MTL)、P物質(zhì)(substance P,SP)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholine enzyme,AchE)等 北京華英生物技術(shù)研究所;有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品包括乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸等 阿拉丁試劑(上海)有限公司;Minisart 16541-K針筒過濾膜 Sartorius(德國)有限公司;其它試劑包括10%中性福爾馬林、羧甲基纖維素鈉、活性炭、甲醛、鹽酸、冰醋酸、氯化鈉等 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

華衛(wèi)德朗DR-200BS酶標(biāo)分析儀 無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司;Leica RM2125RTS手動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、Leica RM2235組織切片機(jī) 德國Leica公司;奧特光學(xué)-BKFL熒光顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)便秘模型 參照李業(yè)鵬等[14]方法并根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)加以改進(jìn),制定小鼠便秘模型造模方法,采用30 mg/kg/d劑量的復(fù)方地芬諾酯灌胃小鼠,連續(xù)3 d。通過對模型組與對照組在首粒黑便排便時(shí)間、6 h排便粒數(shù)及排便重量方面的比較,判斷是否建立了穩(wěn)定的小鼠便秘模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組、飼養(yǎng)環(huán)境和便秘干預(yù)實(shí)驗(yàn) 昆明小鼠60只,雌性、4周齡、體質(zhì)量(27±1) g;適應(yīng)性喂養(yǎng)普通維持飼料7 d后,按體重隨機(jī)分為6組,分別為:健康組、便秘模型對照組、比沙可啶組(100 mg/kg/d)、L-PHGG低劑量組(600 mg/kg/d)、L-PHGG中劑量組(1200 mg/kg/d)、L-PHGG高劑量組(1800 mg/kg/d),使用生理鹽水溶解比沙可啶及低分子量瓜爾豆膳食纖維固體粉末,配制成對應(yīng)濃度溶液后,進(jìn)行灌胃,每組10只。室溫保持在(25±5) ℃,相對濕度(50%±10%),12 h明暗交替(7:00～19:00照明)。

實(shí)驗(yàn)周期為18 d,前14 d每天上午8:00給小鼠灌胃,健康組和模型組以10 mL/kg/d灌胃生理鹽水;比沙可啶組灌胃100 mg/kg/d比沙可啶[15];樣品組以相對應(yīng)劑量L-PHGG灌胃各組,從第15 d開始,除健康組外其他各組分別以30 mg/kg/d灌胃復(fù)方地芬諾酯建模,連續(xù)灌胃4 d,期間繼續(xù)灌胃相應(yīng)樣品,小鼠自由飲食和飲水,直至實(shí)驗(yàn)最后1 d。

1.2.3 小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn) 配制30 mL活性炭水:稱取活性炭末3.0 g,加入30 mL蒸餾水,再加入0.3 g的羧甲基纖維素鈉后混勻。

參照李貴節(jié)等[15]的方法并做修改,從實(shí)驗(yàn)第15 d起,除健康組之外,其余各組每組隨機(jī)取5只小鼠,連續(xù)灌胃3 d復(fù)方地芬諾酯后,將小鼠禁食18 h之后,再次灌胃復(fù)方地芬諾酯,然后以劑量0.01 mL/g小鼠體重灌胃含10%活性炭的活性炭水。灌胃活性炭水25 min之后,將小鼠脫頸處死,剖開腹腔并分離小鼠小腸,剪取上自幽門、下至回盲腸的整根小腸,將整條小腸自然拉成直線(不繃緊,不彎曲),以測量小腸長度,即為“小腸總長度”,從幽門至活性炭前沿為“活性炭推進(jìn)距離”,計(jì)算小腸推進(jìn)率。

1.2.4 首粒黑便排出時(shí)間及6 h內(nèi)黑便粒數(shù)與濕重 參照李貴節(jié)等[15]的方法并做修改,從實(shí)驗(yàn)第15 d起,除健康組之外,將其余各組的每組剩余5只小鼠連續(xù)4 d灌胃復(fù)方地芬諾酯,最后1 d禁食不禁水18 h;之后單籠分裝,按1.2.2方法正常灌胃和飼養(yǎng),同時(shí)記錄每只小鼠首粒黑便排放時(shí)間及6 h內(nèi)排放的黑便粒數(shù),并稱量黑便的濕重。

首粒糞便排出時(shí)間縮短量(%)=(模型數(shù)據(jù)-樣品數(shù)據(jù))/模型數(shù)據(jù)×100

糞便濕重增加量(%)=(樣品數(shù)據(jù)-模型數(shù)據(jù))/模型數(shù)據(jù)×100

1.2.5 小鼠血清指標(biāo)的檢測 小鼠摘眼球取血,室溫放置4 h,在4 ℃、3000 r/min條件下離心10 min,取上層血清,按MTL、SP、VIP、AchE試劑盒說明書的方法測定血清中上述因子水平[15]。

血清因子水平增加量(%)=(樣品數(shù)據(jù)-模型數(shù)據(jù))/模型數(shù)據(jù)×100

1.2.6 蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)切片 頸椎脫臼處死小鼠并解剖,取距離回盲腸2 cm處長2 cm的小腸,放入10%中性福爾馬林溶液浸泡,做常規(guī)HE切片,對小腸的HE染色組織切片用顯微鏡拍照[15]。

1.2.7 小鼠糞便中有機(jī)酸含量的測定 參照康莉等[16]的方法并做修改,配制20、40、60、80、100 mmol/L等有機(jī)酸梯度混合標(biāo)樣,用于有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定,其中檢測條件:流動相為5 mmo/L硫酸,流速0.6 mL/min,分析柱內(nèi)部溫度50 ℃,外部溫度55 ℃,自動進(jìn)樣器進(jìn)樣,進(jìn)樣量為20 μL。將新鮮糞便粉碎,準(zhǔn)確稱取一定的樣品,按照4 g/mL濃度加入超純水,充分混勻后,4 ℃、12000 r/min離心20 min,然后使用0.45 μm一次性針筒過濾膜過濾,收集濾液用于短鏈脂肪酸的測定。

有機(jī)酸含量增加量(%)=(其他組數(shù)據(jù)-模型組數(shù)據(jù))/模型組數(shù)據(jù)×100

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 L-PHGG對昆明小鼠小腸推進(jìn)率的影響

L-PHGG對昆明小鼠小腸推進(jìn)率的影響見表1。健康組小鼠小腸推進(jìn)率顯著高于模型組(p<0.05),增加量為131.6%;與陽性對照藥物比沙可啶組相比,L-PHGG中劑量組推進(jìn)率與其接近,L-PHGG高劑量組推進(jìn)率升高,但無顯著性差異(p>0.05);與模型組相比,比沙可啶組、L-PHGG中劑量和高劑量組小鼠的小腸推進(jìn)率顯著提高(p<0.05),分別增加了57.0%、54.4%和81.6%,而L-PHGG低劑量組的小腸推進(jìn)率增加了32.4%。表明在誘導(dǎo)便秘的藥物復(fù)方地芬諾酯作用下,小腸蠕動能力下降,便秘癥狀嚴(yán)重,而中劑量和高劑量的L-PHGG均能使活性炭在小腸中的推進(jìn)距離大幅度提高,促進(jìn)腸蠕動。

表1 L-PHGG對復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)便秘小鼠小腸推進(jìn)率的影響Table 1 Effect of L-PHGG on the small intestinal propulsion rates in diphenoxylate-induced constipation mice

2.2 L-PHGG對昆明小鼠首粒黑便排出時(shí)間的影響

L-PHGG對昆明小鼠首粒黑便排出時(shí)間的影響見表2。健康組小鼠首粒黑便排出時(shí)間顯著少于模型組(p<0.05),縮短量為57.7%;與陽性對照藥物比沙可啶組相比,除L-PHGG低劑量組外有顯著改善外(p<0.05),其他兩組均無顯著改善(p>0.05);與模型組相比,比沙可啶組、L-PHGG低、中、高劑量組小鼠的時(shí)間均顯著減少(p<0.05),分別縮短了42.4%、21.9%、29.0%和34.4%。表明不同劑量的L-PHGG均有效地減少了便秘小鼠首粒黑便的排除時(shí)間,緩解便秘癥狀。

表2 L-PHGG對復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)便秘小鼠首粒黑便排出時(shí)間的影響Table 2 Effect of L-PHGG on defecation time for the first black stool in diphenoxylate-induced constipation mice

2.3 L-PHGG對昆明小鼠6 h排黑便參數(shù)的影響

L-PHGG對昆明小鼠6 h內(nèi)排黑便濕重及粒數(shù)的影響見表3。健康組小鼠6 h內(nèi)黑便粒數(shù)與濕重均顯著高于便秘模型組小鼠(p<0.05);與陽性對照藥物比沙可啶組相比,除L-PHGG低劑量組在6 h糞便粒數(shù)上有顯著差異外(p<0.05),各劑量的L-PHGG組對昆明小鼠6 h內(nèi)排黑便濕重及粒數(shù)均無顯著差異(p>0.05)。與模型組相比,比沙可啶組、L-PHGG低、中、高劑量組小鼠的黑便粒數(shù)均顯著上升(p<0.05),同時(shí)黑便濕重也顯著增加(p<0.05),分別增加了78.6%、64.3%、79.1%和85.6%;表明不同劑量的L-PHGG均能提高便秘小鼠的糞便濕重及糞便個(gè)數(shù)。

表3 L-PHGG對復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)便秘小鼠6 h黑便濕重及粒數(shù)的影響Table 3 Effect of L-PHGG on black fecal wet weight and fecal number within 6 hours in diphenoxylate-induced constipation mice

2.4 L-PHGG對昆明小鼠血清因子水平的影響

L-PHGG對昆明小鼠血清因子水平的影響見表4。健康組小鼠血清指標(biāo)中MTL、SP和活性VIP含量均顯著高于便秘模型組小鼠(p<0.05),提高量分別為67.2%、41.6%和16.0%;而AchE因子水平,健康組與模型組差異不顯著(p>0.05)。與陽性對照藥物比沙可啶組相比,除L-PHGG低劑量組的AchE因子有顯著差異外(p<0.05),其他劑量的L-PHGG均未對小鼠血清因子產(chǎn)生顯著差異(p>0.05)。與模型組相比,不同劑量的L-PHGG組中的MTL因子和VIP因子均得到顯著提高(p<0.05),SP因子含量分別增加27.8%、44.1%和70.1%,VIP因子水平分別增加11.1%、9.3%和32.6%,并且高劑量的L-PHGG可顯著降低AchE因子水平(p<0.05),比沙可啶組的SP因子和VIP因子分別增加53.0%和10.6%。以上血清結(jié)果表明,L-PHGG飲食干預(yù)可改善由于便秘引起的MTL、VIP、AchE等血清因子異常的情況。

2.5 L-PHGG對復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)的昆明小鼠小腸組織生態(tài)學(xué)的影響

L-PHGG對昆明小鼠小腸絨毛組織形態(tài)學(xué)的影響見圖1。健康組小鼠小腸絨毛整齊、稠密、長度均勻,且無炎癥細(xì)胞,便秘模型對照組小鼠小腸絨毛出現(xiàn)明顯斷裂,并且數(shù)量稀疏。陽性對照組比沙可啶組與模型組小鼠相比,小腸絨毛較為正常,且與健康組相近,樣品組中小鼠小腸絨毛有一定損傷,損傷程度較輕,絨毛較為整齊,且隨著L-PHGG濃度的增加,小腸絨毛數(shù)量逐漸增加,且損傷程度逐漸減輕。因此,L-PHGG對由復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)的便秘小鼠小腸絨毛具有一定的保護(hù)作用。

圖1 小鼠各組小腸組織切片圖(HE染色,200×)Fig.1 Histological photographyof small intestine in mice(HE staining,mangnification 200×)注：A:健康組;B:便秘模型對照組;C:比沙可啶組;D:L-PHGG低劑量組;E:L-PHGG中劑量組;F:L-PHGG高劑量組。

2.6 L-PHGG對昆明小鼠糞便中有機(jī)酸含量的影響

L-PHGG對昆明小鼠糞便中有機(jī)酸含量的影響見表5。小鼠糞便中有機(jī)酸主要包括乳酸、乙酸和丙酸。健康組小鼠中乳酸、乙酸、丙酸及三種有機(jī)酸總含量均顯著高于模型組(p<0.05),提高率分別為44.7%、96.6%、90.9%和80.3%。與模型組相比,三種劑量的L-PHGG組均可顯著提高糞便中乙酸含量和三種有機(jī)酸總含量(p<0.05),乳酸、乙酸、丙酸三種有機(jī)酸總含量分別增加27.7%、35.3%和50.5%;比沙可啶組中僅有乳酸含量增加,增加量為25.3%;中劑量和高劑量的L-PHGG可顯著提高乳酸的含量(p<0.05),并且高劑量的L-PHGG可顯著提高丙酸的含量(p<0.05);高劑量L-PHGG組的乳酸含量顯著高于陽性對照藥物比沙可啶組(p<0.05)。表明L-PHGG飲食干預(yù)尤其是高劑量的L-PHGG能提高小鼠腸道內(nèi)有機(jī)酸的含量。

表5 L-PHGG對復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)的便秘小鼠糞便中有機(jī)酸含量的影響Table 5 Effect of L-PHGG on organic acid content of faeces in diphenoxylate-induced constipation mice

3 討論與結(jié)論

L-PHGG組較模型組小鼠小腸推進(jìn)率提高,首粒黑便排出時(shí)間縮短,是由于L-PHGG作為益生元能夠促進(jìn)胃腸道的蠕動,促進(jìn)代謝產(chǎn)物的排泄。糞便濕重的增加是由于L-PHGG富含膳食纖維,從而增加了糞便持水性[11-12]。

便秘可誘發(fā)胃腸道激素的變化,其中腸神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)則被廣泛研究[17-18]。而有關(guān)L-PHGG對腸神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)的影響的研究尚未見報(bào)道,本文中L-PHGG組較對照組可以顯著升高M(jìn)TL、VIP、SP血清因子水平,說明L-PHGG能夠有效調(diào)節(jié)胃腸道蠕動,改善由便秘引起的胃腸道激素紊亂。

便秘能引起胃腸道功能紊亂,嚴(yán)重時(shí)會使小腸絨毛斷裂、損傷,故而便秘模型組小鼠小腸絨毛出現(xiàn)明顯斷裂損傷[19]。由于人體腸道內(nèi)缺乏消化L-PHGG的酶,因此L-PHGG可被腸道微生物利用并被代謝為甘露糖和半乳糖。在這個(gè)微生物利用過程中,L-PHGG可促進(jìn)有益菌增殖與發(fā)酵,同時(shí)產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸,刺激腸道神經(jīng),促進(jìn)腸壁蠕動,并提高小腸絨毛的韌性[20]。因此,相較于模型組來說,L-PHGG組小鼠小腸絨毛損傷程度較輕,絨毛較為整齊,且數(shù)量較模型組稠密,由此可以看出L-PHGG對由復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)的便秘小鼠小腸絨毛具有一定的保護(hù)作用。

L-PHGG作為益生元可以促進(jìn)益生菌的增值,產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸,其中較為突出的是能夠明顯地提高乙酸含量,這與Takagi等[21]研究結(jié)果類似,短鏈脂肪酸能夠降低腸道pH,刺激腸道蠕動從而有效地促進(jìn)小腸代謝,推動腸道廢棄物排泄。L-PHGG組小腸推進(jìn)率的提高和首粒黑便排出時(shí)間的縮短則證明了這點(diǎn)。

本文通過L-PHGG對昆明小鼠便秘的預(yù)防作用系統(tǒng)地證明:L-PHGG能有效地改善昆明小鼠的便秘情況,且中、高劑量組便秘預(yù)防效果更好。作為益生元,L-PHGG相比于比沙可啶安全性高,有望開發(fā)成緩解便秘的功能性食品。