高良姜殘渣黃酮的分離純化及其抗氧化活性

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(華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642)

高良姜(AlpiniaofficinarumHance),別名良姜、小良姜,是雙子葉藥姜科植物,主產于廣東、廣西、云南、海南、臺灣等地,是一種熱帶多年生的山姜,屬食藥兼用的植物資源[1],具有溫胃止吐、散寒止痛、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗腹瀉等功效,可用于食品的調味劑、著色劑及抗氧化劑,醫藥方面還可用于治療消化不良、反酸嘔吐、胃潰瘍等消化道系統疾病[2-4],具有較高商業價值。

高良姜中有效成分主要為揮發油、黃酮類及二芳基庚烷類化合物。目前對高良姜的開發利用主要集中在提取揮發油,其可作為鎮痛止嘔藥使用,也可應用于食品、日化、農業等領域。然而高良姜中揮發油含量一般只有1%左右,提取揮發油后的殘渣占到99%,且目前基本上沒有加以利用,造成極大的資源浪費。高良姜殘渣中含有豐富的黃酮類物質,具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、鎮痛等作用[5-10]。國內已有通過大孔樹脂和薄層層析法分離純化高良姜總黃酮的研究,結果表明,經純化后黃酮純度能得到有效提升[11-12]。但相關研究仍相對匱乏,且未見對純化前后的高良姜黃酮進行功能性測定的研究。

本研究以提取揮發油后的高良姜殘渣為原料,提取其中的黃酮,并利用大孔樹脂進行分離純化,探討其分離純化條件,以期獲得純度較高、抗氧化活性較強的黃酮類化合物,為高良姜資源的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高良姜 采自廣東湛江徐聞縣,經自然干燥成樣品;蘆丁標準品(純度≥98%) 上海如吉生物科技有限公司;DPPH·標準品(純度≥99%) 美國Sigma公司;大孔樹脂AB-8、XAD-2、HPD-600、S-8、D-101 鄭州華溢新技術有限公司;大孔樹脂XDA-6、LSA-12、LX-213 西安藍曉科技新材料股份有限公司;硫酸鈉、無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、濃鹽酸、鄰苯三酚 分析純,天津大茂化學試劑廠;三羥甲基氨基甲烷 分析純,美國Sigma公司。

HWS24恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;LRH-150B恒溫培養箱 廣東泰宏君科學儀器股份有限公司;UV-5200紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;HY-5回旋式振蕩器 常州澳華儀器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器有限公司;DW-HL828超低溫冰箱 安徽中科美菱低溫科技股份有限公司;Lab-1C-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高良姜黃酮的提取 以高良姜為原料,粉碎并過20目篩,參考《中國藥典》2015版第四部揮發油測定甲法并作適當修改[13],在料液比1∶12 g/mL、浸泡時間30 min的條件下提取揮發油,提取45 min后制得殘渣。取一定量高良姜殘渣,按料液比1∶40 g/mL加入57%(v/v)的乙醇,在82 ℃水浴下浸提3 h,將所得提取液經離心(5000 r/min,20 min)分離,取上清液于55 ℃、0.025 MPa下旋轉蒸發濃縮至無醇味浸膏,用水稀釋至適當濃度即為黃酮粗提液。

1.2.2 黃酮的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[14],以蘆丁為標準品繪制標準曲線,得到黃酮濃度與吸光度之間的回歸方程:y=5.7611x+0.0561(R2=0.9995),按該方程計算黃酮含量。

1.2.3 樹脂預處理 參考吳彩霞等[15]方法對大孔樹脂進行預處理。

1.2.4 靜態吸附與解吸

1.2.4.1 樹脂的篩選 分別稱取預處理后的大孔樹脂HPD-600、S-8、XDA-6、LSA-12、LX-213、AB-8、D-101各1.000 g于錐形瓶中,加入50 mL濃度為1.5 mg/mL的黃酮粗提液并置于搖床中,恒溫25 ℃振搖(180 r/min)24 h,測定上清液黃酮濃度;用濾網濾去粗提液后,用200 mL蒸餾水沖洗樹脂并移入錐形瓶中,加入50 mL無水乙醇,于恒溫25 ℃下振搖(180 r/min)解吸24 h,測定上清液中黃酮濃度。

參照以下公式計算吸附率(Q1)、解吸率(Q2)和黃酮得率(Q3)。

其中,C0、C1、C2分別為黃酮粗提液、吸附平衡后溶液和解吸平衡后解吸液的濃度(mg/mL);V1、V2分別為吸附后濾液和解吸液的體積(mL);m為大孔樹脂質量(g)。

1.2.4.2 吸附與解吸動力學 按1.2.4.1的條件,對所篩選出的3種樹脂進行靜態吸附,每1 h測定一次上清液的黃酮濃度至吸附平衡,再用50 mL 70%的乙醇進行靜態解吸,每10 min測定一次上清液的黃酮濃度至解吸平衡,計算樹脂的吸附量和解吸量,繪制吸附和解吸動力學曲線。

1.2.4.3 洗脫液的篩選 取吸附飽和的XDA-6大孔樹脂1 g于5個錐形瓶中,加入50 mL濃度分別為60%、70%、80%、90%、100%(v/v)乙醇,按1.2.4.1的條件進行靜態解吸,取上清液測定解吸平衡時黃酮濃度,篩選最優的洗脫液。

1.2.5 動態吸附與解吸

1.2.5.1 上樣流速對動態吸附的影響 采用濕法裝柱將預處理好的XDA-6大孔樹脂裝入層析柱中,將濃度為2 mg/mL的黃酮粗提液分別按1、2、3 BV/h的流速上樣,每10 mL收集一管,測定其黃酮濃度,繪制動態滲透曲線。

1.2.5.2 上樣液濃度對動態吸附的影響 采用濕法裝柱將預處理好的XDA-6大孔樹脂裝入層析柱中,將濃度分別為1、2、3 mg/mL的粗提液按2 BV/h的流速上樣,每10 mL收集一管,測定其黃酮濃度,繪制動態滲透曲線。

1.2.5.3 洗脫液流速對動態解吸的影響 將粗提液按最優條件上樣,以蒸餾水充分洗去雜質,用70%乙醇分別按0.5、1.5、2.5 mL/min的流速進行動態洗脫,每2 mL流出液收集一管,測定流出液的黃酮濃度,繪制洗脫曲線。

1.2.6 純化效果評價

1.2.6.1 純度的測定 將純化前后的黃酮溶液于55 ℃、0.025 MPa下旋轉蒸發濃縮至無醇味,然后置于-80 ℃中預冷24 h,在真空度為0.1 kPa,冷凍溫度為-55 ℃,冷凍時間為24 h的條件下真空冷凍干燥成干粉樣品,取等質量凍干樣品用蒸餾水溶解并測定黃酮含量,按下式計算純度:

式中,c為凍干樣品溶液的黃酮濃度(mg/mL);v為定容體積(mL);m0為凍干樣品質量(mg)。

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的測定 將純化前后的樣品溶液稀釋至等濃度,測定DPPH自由基清除能力[16],按以下公式計算清除率:

式中,A0為樣品溶劑與DPPH-乙醇溶液混合液的吸光值;A為樣品溶液與DPPH-乙醇溶液混合液的吸光值;B為樣品溶液與無水乙醇混合液的吸光值。

1.2.6.3 超氧陰離子自由基清除率的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[17]測定純化前后樣品溶液的超氧陰離子自由基清除能力,按以下公式計算清除率:

式中,F0為Tris-HCl、樣品溶劑與鄰苯三酚-HCl溶液的吸光度增加速率;F為Tris-HCl、樣液與鄰苯三酚-HCl溶液的吸光度增加速率。

1.2.6.4 還原能力的測定 采用普魯士藍法[18]測定純化前后樣品溶液的還原能力,吸光值越高,還原能力越強。

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016進行數據分析處理,Origin 9.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 靜態吸附與解吸

2.1.1 樹脂篩選 通過靜態吸附和解吸試驗,7種大孔樹脂的吸附率和解吸率測定結果如表1所示。

表1 7種大孔樹脂的吸附和解吸性能Table 1 Capacities of absorption and desorption of 7 kinds of macroporous resins

由表1可知,吸附率大小排序為:XDA-6>LSA-12>AB-8>S-8>HPD-600>LX-213>D-101;解吸率從高到底的順序為:D-101>LX-213>AB-8>XDA-6>LSA-12>HPD-600>S-8;黃酮得率從高到底的順序為:AB-8>XDA-6>LX-213>LSA-12>D-101>HPD-600>S-8;綜合考慮吸附率、解吸率及黃酮得率,其中AB-8、XDA-6和LX-213的黃酮得率都在75%以上且較為接近,因此,選用這3種樹脂進行下一步的篩選。

2.1.2 吸附與解吸動力學 根據2.1.1結果篩選出的3種大孔樹脂吸附和解吸動力學曲線分別如圖1和圖2所示。

圖1 3種大孔樹脂的吸附動力學曲線Fig.1 Absorption kinetics curve of 3 kinds of macroporous resins

圖2 3種大孔樹脂的解吸動力學曲線Fig.2 Desorption kinetics curve of 3 kinds of macroporous resins

從圖1可以看出,3種樹脂在前5 h的吸附量增加迅速,吸附速度較快,至8 h后基本達到平衡,此時,3種樹脂的吸附量以XDA-6最大,其次是AB-8,LSA-12最小;從圖2的解吸效果來看,XDA-6和LSA-12的解吸速度相對較快,10 min即可達到解吸平衡,且相同時間下XDA-6的解吸量高于LSA-12,而AB-8解吸速度相對較慢,需20 min才達到解吸平衡。綜合考慮,XDA-6更適合于高良姜黃酮的分離純化。

2.1.3 洗脫液篩選 不同濃度乙醇溶液的解吸結果如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對解吸率的影響Fig.3 Effect of concentration of ethanol on desorption rate

由于乙醇濃度不同其極性強弱也有所不同,從而對黃酮的解吸產生影響,從圖3可知,隨乙醇濃度的升高解吸率呈先上升后下降的趨勢,以70%乙醇的解吸率最高,達97.9%,當乙醇濃度大于70%時解吸率下降,說明70%乙醇極性適中,適合于高良姜黃酮的洗脫。

2.2 動態吸附與洗脫

2.2.1 上樣流速對動態吸附的影響 不同上樣流速的動態滲透曲線如圖4所示。

圖4 上樣流速對動態吸附的影響Fig.4 Effects of sample flow rate on dynamic absorption

由圖4可以看出,泄漏濃度會隨上樣流速的增加而上升,流速為1、2、3 BV/h時,達到泄漏點的流出液分別為31.6、31.6、21.0 BV,表明流速過快會使樹脂吸附能力變差,降低黃酮利用率。因此,上樣流速不宜過大,而較慢(1 BV/h)的流速使樹脂達泄漏點的時間較長,樹脂吸附效率較低,并且容易造成黃酮粗提取物在樹脂柱上層析出和沉積,影響柱床的穩定從而影響純化效果。綜合考慮,選擇2 BV/h為最適上樣流速,此時,泄漏點的流出液體積為31.6 BV。

2.2.2 上樣液濃度對動態吸附的影響 不同上樣液濃度的動態滲透曲線,結果如圖5所示。

圖5 上樣液濃度對動態吸附的影響Fig.5 Effects of flavonoid concentration of sample on dynamic absorption

由圖5可知,上樣濃度對黃酮的泄漏影響較大,上樣濃度較高,為3 mg/mL時,黃酮泄漏較多,樹脂過早達到泄漏點,且容易造成樣品的浪費及柱床堵塞;而上樣濃度較低,為1 mg/mL時,樹脂的吸附效率較低。因此,上樣液的濃度以2 mg/mL為宜,對應的泄漏點體積為31.6 BV。

2.2.3 洗脫液流速及用量對動態解吸的影響 不同洗脫液流速的洗脫曲線如圖6所示。

圖6 洗脫液流速對動態解吸的影響Fig.6 Effects of elution flow rate on dynamic desorption

由圖6可以看出,1.5 mL/min和2.5 mL/min的流速洗脫效果較好,峰形對稱,峰較高,而以0.5 mL/min的流速洗脫時,出峰較早,濃度峰不完整。綜合考慮生產效率和經濟性,選擇洗脫流速為2.5 mL/min。當洗脫液用量達到3.1 BV時,流出液已基本不含黃酮,故洗脫液用量以3.1 BV為佳。

2.3 純化效果評價

2.3.1 純度測定 測定純化前后黃酮的純度發現,黃酮經分離純化后,純度由43.55%±0.15%提高到了85.42%±0.64%,純度提升為原來的1.9倍,純化效果理想,RSD值小于1.5%,說明實驗精度高,效果顯著。

2.3.2 DPPH自由基清除率的測定 純化前后的高良姜殘渣黃酮對DPPH自由基的清除效果如圖7所示。

圖7 DPPH自由基清除效果Fig.7 Results of DPPH free radicals scavenging

從圖7可知,高良姜殘渣黃酮對DPPH自由基清除能力隨濃度增加而增強;相同濃度下,純化后的黃酮對DPPH自由基的清除能力較強,清除率極顯著高于純化前的黃酮(p<0.05)。IC50由純化前的0.014 mg/mL降低到純化后的0.012 mg/mL。

2.3.3 超氧陰離子自由基清除率的測定 分別測定純化前后的高良姜殘渣黃酮對超氧陰離子自由基的清除效果,結果如圖8所示。

圖8 超氧陰離子自由基清除效果Fig.8 Results of superoxide anion free radicals scavenging

從圖8可得,高良姜黃酮對超氧陰離子自由基清除能力隨濃度增加而增強;在黃酮濃度為0.12～0.24 mg/mL的范圍內,等濃度下純化后黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力均比純化前強,清除效果顯著優于純化前(p<0.05),其純化前高良姜黃酮的IC50為0.222 mg/mL,經純化后降低到了0.186 mg/mL。

2.3.4 還原能力的測定 純化前后的高良姜殘渣黃酮的還原能力結果如圖9所示。

圖9 還原能力測定Fig.9 Results of reducing ability test

從圖9可以看出,純化后黃酮的還原能力顯著優于純化前(p<0.05);在低濃度時,純化前和純化后的高良姜黃酮還原能力較為接近,但隨濃度增加至0.2 mg/mL時,純化后黃酮的還原能力大于純化前的,且隨濃度的上升,純化后黃酮還原能力增長速度要比純化前快,當濃度達到0.65 mg/mL時,純化后黃酮的還原能力為2.55大于純化前的1.97?？梢?高良姜黃酮經純化后的抗氧化活性增加。

3 結論

通過測定7種大孔樹脂對高良姜黃酮的靜態吸附和解吸能力,篩選出效果最優的大孔樹脂為XDA-6,并進行動態吸附和解吸試驗,優化出最佳分離純化條件為:上樣流速2 BV/h,上樣液濃度2 mg/mL,上樣量31.6BV,洗脫液為70%(v/v)乙醇,洗脫液流速2.5 mL/min,用量3.1BV,在此條件下,黃酮的純度由43.55%±0.15%提高到了85.42%±0.64%;純化后的黃酮具有更強的還原能力,對DPPH和超氧陰離子自由基清除率有所提高,IC50值分別由純化前的0.014、0.222 mg/mL降低到純化后的0.012、0.186 mg/mL,說明純化有利于提高黃酮的抗氧化活性。