GST融合蛋白表達系統在實驗教學中的應用

張淑芝， 李學紅， 劉春香

(濰坊學院 生物與農業工程學院,山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東 濰坊 261061)

0 引 言

實驗教學是高校課程體系的重要組成部分，對提高學生的動手操作能力和實踐創新能力有著不可或缺的作用。在傳統的生物學實驗教學過程中，驗證性實驗較多，而綜合設計性實驗較少；各實驗獨立單一，聯系性不強[1-2]。為了培養學生的創新能力和科研素質，提高實驗教學效果，在保留原有的生物學實驗課程的基礎上，增設了生物學開放性實驗[3-5]。

近年來，隨著各模式生物基因組測序的相繼完成，蛋白質組學發展成為生命科學領域新的研究熱點。蛋白質是基因功能的最終執行者，研究蛋白質結構和功能對于探究生命奧秘，指導醫藥衛生具有重要意義[6]。獲得大量高純度有活性的蛋白質是進行蛋白質研究的基本條件。GST融合蛋白表達系統作為一種常見的原核蛋白表達系統[7]，本身具有細胞增殖速度快、蛋白表達量高、穩定性好、表達產物易于純化等優點，而被廣泛應用于各實驗研究[8-11]。

水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是一類廣泛分布于細胞膜上的高效水分子轉運孔道，目前已經發現的水通道蛋白家族成員有13個(AQP0～AQP12)[12-13]。AQP7歸屬水通道蛋白的第2個亞家族，是一種存在于細胞膜上的水和甘油雙轉運孔道，因在脂肪代謝、動脈粥樣硬化等生理條件下發揮重要作用，而成為近年來的研究熱點[14-17]。本文選用與教師科研課題相結合的題目，基于GST融合蛋白表達系統構建原核表達載體pGEX-4T-1∕AQP7，IPTG誘導表達GST-AQP7融合蛋白，并對表達產物進行純化。

1 材料與方法

1.1 材 料

pGEX-4T-1表達載體、E.coliDH5α菌株、E.coliBL21菌株為本實驗室保存。pMD18-T載體、連接酶、限制性內切酶、DNA 相對分子質量標準為TAKARA 公司產品；PCR相關產品、IPTG、蛋白相對分子質量標準為生工生物工程(上海)股份有限公司產品；Glutathione Sepharose 4B為Pharmacia公司產品。

1.2 擴增AQP7-C末端親水性肽段區基因片段

參照Genebank數據庫，借助核苷酸序列分析軟件DNA Strider對小鼠AQP7基因全序列進行親水性分析。引物選取：上游5′-GAATTCCCACAGGATCCTC-AGAG-3′，下游5′-CTCGAGCACAGAGCCACTTATG-3′。以實驗室現有質粒pcDNA3.1/AQP7為模板，PCR擴增AQP7-C末端，自796～894位共99bp的親水性肽段區基因片段。擴增參數：95 ℃ 1 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.3 構建重組載體pMD18-T/AQP7和pGEX-4T-1/AQP7

pMD18-T和PCR擴增產物混合，室溫條件下T4連接酶連接1 h。將連接產物與感受態細胞DH5α按1∶10的體積比進行轉化，37 ℃培養過夜，挑取單克隆，繼續培養后，進行重組質粒提取。用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對pMD18-T/AQP7重組質粒酶切鑒定，選取陽性質粒，回收對應的AQP7-C末端親水性肽段區基因片段。回收片段與雙酶切后的pGEX-4T-1表達載體16 ℃過夜連接，轉化，質粒提取，并對重組表達載體pGEX-4T-1/AQP7進行PCR鑒定和DNA測序分析。

1.4 表達純化GST-AQP7融合蛋白

取10 μL pGEX-4T-1/AQP7重組表達載體轉化入100 μLE.coliBL21感受態細胞，接種LB/Amp+固體培養基，37 ℃培養過夜。挑取單菌落克隆接種于LB/Amp+液體培養基，先進行2 mL小量培養，當細菌生長達到對數生長期，即菌液OD600值為0.5時，加入不同濃度的IPTG誘導蛋白表達，IPTG濃度依次設置為0、0.1、0.2、0.5 mmol/L。SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況，優化表達條件，確定有效誘導GST-AQP7融合蛋白表達的IPTG濃度。將轉化pGEX-4T-1/AQP7質粒的菌液擴大培養，大量誘導表達GST-AQP7融合蛋白，超聲裂解細菌，離心，取上清，用Glutathione Sepharose 4B親和層析法收集上清液中的融合蛋白，經洗脫液洗脫，得高純度的GST-AQP7融合蛋白。

2 結果與分析

2.1 AQP7-C末端肽段親水性分析

用DNA Strider序列軟件對AQP7基因全序列進行親水性分析，結果如圖1所示，水平線上方為AQP7疏水肽段區;下方為親水肽段區。為提高融合蛋白的可溶性，以利于后續對表達蛋白的純化，本研究選取AQP7-C末端，自266～298共33個氨基酸的親水性肽段區為研究對象。

圖1 AQP7蛋白序列親水性分析

2.2 AQP7-C末端基因片段的PCR擴增

以pcDNA3.1/AQP7質粒為模板，PCR擴增AQP7-C末端親水區基因序列，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在約100bp處出現特異性條帶(見圖2)，與預期設計的99bp DNA片段長度相符合。

2.3 重組質粒pMD18-T/AQP7的酶切鑒定

重組質粒pMD18-T/AQP7經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果呈現一大和一小兩條帶，大片段為pMD18-T載體(2692bp)，小片段為AQP7-C末端親水性肽段區基因片段(99bp)，如圖3所示。酶切鑒定結果表明重組質粒pMD18-T/AQP7構建成功。

圖2 AQP7-C端親水區基因片段的PCR擴增

M-DL2000 DNA分子量標準,1～2-AQP7-C末端親水區基因片段的PCR擴增產物

圖3 重組質粒pMD18-T/AQP7的酶切鑒定

M-DL2000 DNA分子量標準,1，2-重組質粒pMD18-T/AQP7的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定結果

2.4 重組表達載體pGEX-4T-1/AQP7的鑒定

選取鑒定正確的pMD18-T/AQP7重組質粒，酶切回收AQP7-C末端親水性肽段區基因片段，連接到pGEX-4T-1原核表達載體，構建重組表達載體pGEX-4T-1/AQP7。將構建好的pGEX-4T-1/AQP7進行PCR鑒定，電泳結果呈現約99bp的特異條帶(見圖4)，證明重組表達載體構建正確。用表達載體pGEX-4T-1特異性的引物進行DNA測序，結果如圖5所示，進一步證實了目的基因的正確性。

圖5 重組表達載體pGEX-4T-1/AQP7的測序結果

2.5 GST-AQP7融合蛋白的誘導表達及純化

將轉化重組表達載體pGEX-4T-1/AQP7的對數生長期菌液用不同濃度的IPTG誘導，優化表達條件。發現,當IPTG濃度為0.1 mmol/L時，融合蛋白表達效率最高，故選取該濃度大量誘導表達GST-AQP7融合蛋白。收集菌體，超聲裂解破碎細胞，離心，取上清液，用Glutathione Sepharose 4B親和層析純化融合蛋白，SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍染色，結果如圖6(a)所示。表明Glutathione Sepharose 4B親和層析法可有效純化GST-AQP7融合蛋白，經純化后的上清液中幾乎沒有融合蛋白殘留。擴增的AQP7-C末端親水區基因片段大小為99bp，對應的蛋白相對分子質量約4kD，因為GST標簽本身相對分子質量約為26kD，計算GST-AQP7融合蛋白的相對分子質量約為30kD，SDS-PAGE蛋白電泳結果驗證了表達的GST-AQP7融合蛋白大小的正確性(見圖6(b))。上述實驗結果表明，融合蛋白在E.coli BL21原核細胞中高效表達且被有效純化。

(a) Glutathione Sepharose 4B親和層析法對GST-AQP7融合蛋白的純化效率鑒定

M-蛋白分子量標準,1-GST標簽蛋白對照,2-純化的GST-AQP7融合蛋白,3-Glutathione Sepharose 4B結合后的上清液

M-蛋白分子量標準,1，4-BSA蛋白對照(66kD),2，5-純化的GST-AQP7融合蛋白(30kD),3，6-GST標簽蛋白對照(26kD)

3 結 語

GST融合蛋白表達系統作為眾多蛋白表達系統中的一種，因表達效率高，純化條件溫和，能很好地保持蛋白固有的結構和功能而被廣泛應用于各實驗研究[8-11]。本實驗涉及目的基因的克隆，表達載體的構建，目的蛋白的誘導表達與純化，涵蓋了現代分子生物學的多項關鍵實驗技術，可以很好地訓練學生的實驗操作技能。借助實驗，學生分析問題和解決問題的能力同樣得到了提升，例如在確定IPTG有效誘導濃度的問題上，學生通過嘗試設置不同濃度的對比實驗，最終確定本實驗中誘導GST-AQP7高表達的IPTG濃度為0.1 mmol/L；在菌體的超聲裂解問題上，為保證菌體的有效破碎，同時又要兼顧GST-AQP7融合蛋白的完整性，學生經過多次預實驗，最終將超聲程序設定為：超聲5 s，間歇5 s，共重復25次。學生在順利完成上述實驗的基礎上，對本實驗的后續研究表現出濃厚的興趣，如：融合蛋白中GST標簽的切除，對純化蛋白的進一步鑒定及有效應用等。因此，本實驗還有很大的延伸空間，可以指導學生根據自身的專業基礎和學習興趣，開展后續實驗研究，以培養學生的科學探究精神。