無創性肢體缺血預適應對糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用及缺血下肢的影響

高廣生　潘蕊　苗曉東　李虹　聶亞東　劉淑華　李姝婷　朱東放　李懿宏

[摘要] 目的 觀察無創性肢體缺血預適應對糖尿病下肢缺血大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用及對缺血下肢的影響。方法 將成功建模的糖尿病下肢缺血大鼠隨機分為2組（每組27例）：心肌缺血/再灌注組（A組）及預適應組（B組）。A組大鼠冠狀動脈左前降支結扎30 min后開通2 h；B組大鼠缺血下肢行結扎5 min后開通5 min，共3次，連續3 d，第4天同A組實驗。觀察比較兩組大鼠心電圖ST段變化程度、肌酸激酶同工酶（CK-MB）值、缺血心肌質量與左心室質量的比值（AAR/LV）、梗死心肌質量與左心室質量的比值（IA/LV）、梗死心肌質量與缺血心肌質量的比值（IA/AAR）以及缺血下肢與健肢的血流值比率（R/L）。 結果 與A組相比，B組ST段抬高幅度、CK-MB值、IA/LV、IA/AAR值明顯降低，R/L有降低趨勢，但差異無統計學意義（P>0.01）。 結論 無創性肢體缺血預適應能明顯降低大鼠心肌缺血/再灌注時的ST段抬高幅度、CK-MB值及心肌梗死面積，且對已發生缺血的下肢無顯著影響。

[關鍵詞] 缺血預適應；糖尿病；心肌梗死；缺血下肢

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-4062（2018）07（a）-0054-03

無創性肢體缺血預適應是指預先對一肢體進行缺血處理，對隨后發生的遠隔器官的缺血損傷有保護作用。很多動物實驗及臨床研究都證實了缺血預適應的心臟保護作用[1]，但關于缺血預適應對合并糖尿病的患者或動物的心臟保護作用的研究相對較少，且結果不一[2-4]。同時，因臨床上很多糖尿病患者伴有肢體外周血管病變，而缺血預適應對病變肢體血管的影響尚無臨床及動物研究。該研究擬建立糖尿病并下肢慢性缺血的大鼠模型[5]，觀察無創性缺血預適應對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用及對缺血下肢的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 6～7周齡健康雄性Wistar大鼠60只，體質量200～250 g，由哈爾濱市呼蘭區楊林鄉鼎盛養殖場提供并飼養。

1.1.2 試劑 檸檬酸鈉緩沖液、戊巴比妥鈉、水合氯醛、CK-MB試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司），鏈硫脲菌素、Evans blue染色劑（美國sigma），TTC染色劑（上海化學試劑公司）。

1.1.3 設備 血糖儀（羅氏）、激光多普勒血流成像儀（瑞典）、多功能電生理儀（華南醫用電氣）、超低溫高速離心機（Backman Coulter）、電熱恒溫振蕩水浴箱（上海）、冰箱（新飛）、電子分析天平（Mettler Toledo）。

1.2 模型建立與分組實驗

1.2.1 糖尿病模型的建立 高脂飼料（熱量比為蛋白質：脂肪：碳水化合物=1∶3∶1）飼養60名大鼠，6個月后，做標記并稱質量，禁食12 h，不禁水，檸檬酸鈉緩沖液稀釋鏈脲佐菌素，按35 mg/kg的劑量腹腔注射，48 h后用血糖儀測尾靜脈血糖，以隨機血糖>16.7 mmol/L為造模成功，7 d后復測隨機血糖>16.7 mmol/L的大鼠入選實驗，共58只大鼠入選。

1.2.2 下肢缺血模型的建立 58只大鼠均取右下肢造模，左下肢作為對照。2%戊巴比妥鈉以50 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉后，取仰臥位，四肢牽拉固定于手術臺，右下肢備皮消毒，于右側腹股溝處縱行切開右下肢正中的皮膚，暴露血管神經束，分離出股動脈并結扎，激光多普勒血流儀記錄雙下肢血流灌注值，以右下肢比左下肢血流減少約70%確認建模成功，28 d后復測右下肢/左下肢血流比率<75%的大鼠入選實驗，共54只大鼠入選。

1.2.3 進行無創性肢體缺血預適應及心肌缺血/再灌注 將成功建模的54只大鼠隨機分為2組：缺血/再灌注組（A組）及預適應組（B組），各27只。A組大鼠以10%水合氯醛以0.3g/kg的劑量腹腔注射麻醉后，連接肢導心電，氣管切開，呼吸機輔助呼吸，在左鎖骨中線3、4肋間處行縱形切口，以小型開胸器暴露胸腔。切開心包，在冠狀動脈左前降支中、上1/3交界處以絲線結扎30 min后，松開絲線使冠狀動脈開通至2 h。B組大鼠用2%戊巴比妥鈉溶液以30 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉后，以橡皮筋捆綁大鼠右下肢根部至超聲示下肢動脈血流消失，持續5 min，再松開5 min，如此捆綁/松開共3次，連續3 d，第4天操作同A組。

1.3 觀察指標的測定

1.3.1 心電圖 分別在心梗前、心梗后30 min、再灌注后30 min、再灌注后2 h測心電圖ST段抬高幅度。

1.3.2 心肌酶 于再灌注后2 h于右心室取血2 mL，凝固并離心后取血清測CK-MB 值。

1.3.3 心肌梗死面積 右心室取血后結扎左前降支，將Evans blue染色劑從主動脈逆行注入心臟，剪下心臟后用生理鹽水沖洗干凈，放入冰箱中冷凍20 min。垂直心臟長軸方向切片（厚約1 mm）。電子天平稱量左心室質量（LV），再剔取缺血部分（未染色部分）稱質量（ARR），并計算缺血部分質量占左心室質量的百分比（AAR/LV）。將缺血部分切片放入TTC中，37℃水浴30 min，梗死部分呈蒼白色，剔取梗死部分的心肌稱質量（IA），并計算梗死部分質量占左心室質量的百分比（IA/LV），最后計算梗死部分質量與缺血部分質量的百分比（IA/AAR）。

1.3.4 下肢血流值 用激光多普勒血流儀分別記錄預適應組大鼠在預適應前、心梗后30 min及再灌注后2 h雙下肢血流灌注值，以右下肢/左下肢的血流比率（R/L）表示血流灌注程度。

1.4 統計方法

處理采用SPSS 20.0統計學軟件分析，計量數據以均數±標準差（x±s）表示，行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ST段抬高幅度

兩組大鼠心梗前心電圖ST段抬高幅度無明顯差異（P>0.05），與A組相比，B組大鼠在心梗后30 min、再灌注后30 min及再灌注后2 h心電圖ST段明顯回落（P<0.01），見表1。

2.2 心肌酶

與A組相比，B組大鼠CK-MB值明顯降低（P<0.01），見表2。

2.3 心肌梗死面積

兩組大鼠心肌缺血范圍（AAR/LV）無顯著差異（P>0.05），與A組相比，B組大鼠心肌梗死范圍（IA/LV、IA/AAR）明顯縮小（P<0.01），見表2。

2.4 下肢血流灌注程度

與A組相比，B組大鼠在預適應前、心梗后30 min及再灌注后2 h其下肢血流灌注比率略有下降，但其差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

3 討論

2001年NCEP ATPⅢ（美國膽固醇教育計劃成人治療第三次報告）提出糖尿病是冠心病的“等危癥”[6]，此后，糖尿病與冠心病的聯系受到國內外內分泌及心血管醫生的廣泛關注。相比較單純冠心病患者，合并糖尿病的患者心梗的面積更大、死亡率更高，并且心梗的再發率也更高[7]。因此，有效防治糖尿病患者的心肌損傷，對提高其生存率和生活質量具有重要意義。

心梗之后，及時恢復缺血區的血液灌注是減小心梗面積，提高臨床治愈率的重要手段。但再灌注本身也會對缺血區的心肌造成進一步的損傷，即缺血/再灌注損傷。缺血預適應（IP）是指機體組織在經歷反復的短暫的非致死性缺血/缺氧后，對隨后的長時間致死性缺血/缺氧具有高耐受性，這主要表現在實質性細胞死亡顯著減少，梗死范圍顯著減小，并顯著減輕器官功能障礙，但其缺點是直接作用于靶器官，不適合應用于心臟、腦等器官。無創性肢體缺血預適應（NLIP）是指通過對不太重要的肢體進行缺血預適應，可產生對心臟、腦等重要器官的保護作用，減輕缺血/再灌注損傷，比手術治療[8-9]和藥物治療[10]更具優勢，有較高的臨床應用價值。

心電圖ST段抬高是心梗的重要特征，在某種程度上可反映心肌細胞的損傷程度，該研究表明無創性肢體缺血預適應可明顯降低心梗后ST段抬高幅度，減輕心肌細胞損傷。心肌酶學是評價心肌梗死的重要指標，其中CK-MB主要存在于心肌細胞，診斷心肌梗死的敏感性達82.35%、特異性達94.74%，該研究表明無創性肢體缺血預適應可明顯降低CK-MB升高水平，對心肌細胞有保護作用。心肌梗死面積是評價心肌缺血/再灌注損傷程度的金標準[11]，該研究證實無創性肢體缺血預適應可顯著縮小心肌梗死面積，減輕缺血/再灌注損傷程度。臨床上很多糖尿病患者同時伴有肢體外周血管病變，該研究觀察通過對已發生血管病變肢體的缺血預適應，在減輕心肌缺血/再灌注損傷的同時并未對病變肢體產生明顯不良影響。

綜上所述，無創性肢體缺血預適應能對大鼠心肌缺血/再灌注損傷產生明顯的保護作用，且對已發生血管病變的下肢無顯著影響。其產生保護作用的機制目前尚未完全明了，可能與內源性腺苷釋放增加及其受體的激活[12-13]、氧自由基產生減少[14]、炎性細胞的聚集及心肌細胞的凋亡減少[15-16]等因素有關。另外，研究中發現，在心肌梗死或再灌注的不同時期進行缺血預適應所產生的心肌保護作用強度可能存在差異，其差異程度仍有待進一步研究。

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（收稿日期：2018-04-13）