大豆GmLEA的分離及其在種子活力中的功能分析

周亞麗，朱雅婧，趙飛云，王爽，劉骕骦，郭凌凱，趙海紅，麻浩

?

大豆的分離及其在種子活力中的功能分析

周亞麗，朱雅婧，趙飛云，王爽，劉骕骦，郭凌凱，趙海紅，麻浩

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

【目的】大豆（(L.) Merr.）種子從發(fā)育成熟期（R6或R7期）開始具有活力，在此時(shí)期容易受到高溫高濕脅迫，導(dǎo)致種子活力下降。通過對的研究，揭示其高溫高濕脅迫下的表達(dá)水平以及功能，為一步深入研究在參與大豆種子活力形成及響應(yīng)非生物脅迫等方面奠定基礎(chǔ)。【方法】利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，以寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號葉片的cDNA為模板，分離大豆的cDNA序列全長。通過NCBI網(wǎng)站Blast對GmLEA同源性氨基酸序列進(jìn)行搜索，使用MEGA 6.0和DNAMAN多重比對蛋白質(zhì)序列，并采用MEGA 6.0的N-J算法構(gòu)建進(jìn)化樹。通過酵母雙雜交試驗(yàn)驗(yàn)證GmLEA與GmCDPKSK5在酵母體內(nèi)的互作。構(gòu)建亞細(xì)胞定位和雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）載體，通過基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉片分析GmLEA與GmCDPKSK5在煙草葉片細(xì)胞內(nèi)的互作及其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）對的組織特異性表達(dá)及其在高溫高濕脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析。構(gòu)建pBI121融合表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得3個(gè)純合的T3代過表達(dá)擬南芥株系，對高溫高濕脅迫下擬南芥的種子活力進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】獲得大豆的cDNA序列全長，該基因包含一個(gè)長1 377 bp的開放閱讀框（ORF）；且該基因所編碼的蛋白定位在煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞膜上。酵母雙雜交試驗(yàn)與雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）試驗(yàn)結(jié)果表明，GmLEA與GmCDPKSK5分別在酵母體內(nèi)與煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在特異性互作。組織特異性分析結(jié)果表明，主要在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號2個(gè)品種發(fā)育和成熟的種子中表達(dá)。在湘豆3號種子發(fā)育過程中的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，在開花后50 d達(dá)最大值，在寧鎮(zhèn)1號種子發(fā)育過程中該基因的表達(dá)量呈上升的趨勢，在開花后60 d達(dá)到最大值。高溫高濕脅迫后，與對照相比，在湘豆3號中96 h時(shí)下調(diào)表達(dá)，其余時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)，在寧鎮(zhèn)1號中，僅24 h時(shí)下調(diào)表達(dá)。過表達(dá)擬南芥株系經(jīng)高溫高濕脅迫后的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及種子活力均顯著（＜0.01）高于野生型植株?！窘Y(jié)論】參與高溫高濕脅迫下種子活力的形成，與GmCDPKSK5存在特異性互作，二者可能共同參與高溫高濕脅迫下種子活力的形成。

大豆；；；高溫高濕；種子活力

0 引言

【研究意義】大豆是世界上最重要的飼糧兼用作物，可作為植物蛋白最主要來源之一。中國南方是春大豆生產(chǎn)的重要區(qū)域，然而在春大豆種子發(fā)育成熟時(shí)期（R6或R7期），該地區(qū)常處于高溫、多雨、高濕的季節(jié)（6月底—8月初），同時(shí)大豆籽粒大，蛋白、脂肪和水分含量高，導(dǎo)致種子田間劣變嚴(yán)重，種子活力下降[1]。因此，耐高溫高濕的大豆新品種的選育尤為重要。【前人研究進(jìn)展】種子活力（seed vigor）是一種以植物生理學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)為根本的種子生理學(xué)方面的一個(gè)新領(lǐng)域[2]。通常來說，種子活力的高低主要是由遺傳因子和種子發(fā)育過程中的條件一起決定的[3]。種子成熟后，會(huì)開始走向衰老和劣變即老化，這一過程是不可逆的。種子老化與其貯藏條件密切相關(guān)，其中高溫高濕的環(huán)境是引起種子老化的重要因素。一般來說，種子老化后，會(huì)造成活力降低，細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞，內(nèi)部保護(hù)酶系統(tǒng)活性降低，脂質(zhì)過氧化加劇、有毒有害物質(zhì)積累等[4]。目前，對于種子收獲和儲(chǔ)藏時(shí)種子發(fā)生劣變從而導(dǎo)致大豆種子活力降低的各種因素已成為研究的熱點(diǎn)[5-9]。大豆在種子發(fā)育成熟期遭遇高溫、多雨的天氣會(huì)導(dǎo)致種子活力降低、營養(yǎng)品質(zhì)和外觀品質(zhì)下降[3,5,10-11]，高溫高濕脅迫已成為造成大豆種子劣變的重要原因之一[12]。關(guān)于高溫高濕脅迫后對種子活力影響生理方面的研究已取得重大進(jìn)展，但關(guān)于分子機(jī)制的研究較少。近幾年，關(guān)于分子機(jī)制的研究取得了一定的進(jìn)展。在不抗種子田間劣變春大豆種質(zhì)寧鎮(zhèn)1號和抗種子田間劣變春大豆種質(zhì)湘豆3號生理成熟期，宋利茹等對其進(jìn)行模擬田間高溫高濕脅迫處理，通過2-DE電泳和MALDI-TOF/TOF鑒定了33個(gè)差異蛋白，這些蛋白在貯藏蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)過程、氧化還原平衡、能量代謝、蛋白合成等代謝途徑與細(xì)胞過程中發(fā)揮作用[13]。王爽[1]研究發(fā)現(xiàn)在響應(yīng)高溫高濕脅迫中發(fā)揮重要作用，并以GmCDPKSK5為誘餌，構(gòu)建高溫高濕脅迫下抗種子田間劣變春大豆種質(zhì)種子膜蛋白酵母雙雜交文庫，篩選到6個(gè)與之互作的蛋白，GmLEA是篩選到的互作蛋白之一。LEA蛋白的積累與抵抗逆境脅迫之間存在正相關(guān)的關(guān)系，普遍認(rèn)為其在應(yīng)對外界脅迫中發(fā)揮著重要作用[14-15]。研究表明，LEA蛋白具有廣泛的功能，對ABA、低溫、鹽害與干旱等非生物脅迫都具有一定的抵抗作用，在保護(hù)酶活性與膜結(jié)構(gòu)、結(jié)合金屬離子、清除活性氧自由基等方面均發(fā)揮作用[16-17]。【本研究切入點(diǎn)】據(jù)報(bào)道，多種蛋白質(zhì)已被證明與CDPK蛋白相互作用，并在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于LEA蛋白與CDPK的相互作用鮮有報(bào)道，王爽[1]通過酵母雙雜篩選，初步篩選到GmLEA是GmCDPKSK5的互作蛋白之一。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究克隆大豆，并對其編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；分析GmLEA與GmCDPKSK5的互作情況；研究其在高溫高濕脅迫下的表達(dá)水平及功能。以期為進(jìn)一步深入研究在參與大豆種子活力形成和響應(yīng)非生物脅迫等方面奠定基礎(chǔ)，從而為探明田間高溫高濕脅迫下春大豆種子活力形成的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大豆材料為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種植創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室麻浩教授課題組保存的抗種子田間劣變春大豆品種湘豆3號和不抗品種寧鎮(zhèn)1號。試驗(yàn)所需大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自南京博爾迪生物技術(shù)公司；GV3101擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化菌株購自南京百思禾生物科技有限公司；pMD19-T載體購自TaKaRa公司；植物瞬時(shí)表達(dá)載體pA7-GFP、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）載體pSAT1-nEYFP-C1與pSAT1-cEYFP- C1-B、酵母雙雜交試驗(yàn)載體pPR3N-NubG-X、pOST1- NubG與pBT3-SUC以及植物表達(dá)載體pBI121-GUS均由麻浩教授課題組保存。

1.2 總DNA和RNA的提取及cDNA的合成

以2周苗齡的大豆幼葉為材料，按照CTAB法提取DNA，參照杭州寶賽新型植物總RNA提取試劑盒說明書提取大豆各種材料的RNA，采用TaKaRa公司的RTase M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大豆GmLEA的分離與進(jìn)化樹分析

研究所用的引物以NCBI（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/）公布的（Genbank：NM_001251272.1）的CDS序列及DNA序列作為模板，使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物（電子附表1），對湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號的DNA與cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系與反應(yīng)程序參照王爽[1]的研究。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測后回收、連接，并轉(zhuǎn)化。挑取陽性克隆送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序，將測序正確的陽性克隆命名為T-GmLEA。通過NCBI的BLASTN分別對nr數(shù)據(jù)庫和EST數(shù)據(jù)庫同源性搜索，BLASTX對nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性搜索；使用MEGA 6.0和DNAMAN多重比對蛋白質(zhì)序列；采用MEGA 6.0的N-J算法構(gòu)建進(jìn)化樹， BootStrap值為1 000。

1.4 酵母雙雜交試驗(yàn)

pBT3-SUC-GmCDPKSK5與pPR3N-GmLEA載體由麻浩教授課題組保存。將pBT3-SUC-GmCDPKSK5與pPR3N-GmLEA共轉(zhuǎn)入酵母菌株NMY32中，四缺（SD/-Trp-Leu-His-Ade）培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)篩選陽性克隆。pNubG-Fe65與pTSU2-APP質(zhì)粒組合為陽性對照，pPR3N與pTSU2-APP質(zhì)粒組合為陰性對照，pPR3N與pBT3-SUC-GmCDPKSK5質(zhì)粒組合為自激活對照，pPR3N-GmLEA與pBT3-SUC為自激活對照。使用HTX高通量β-半乳糖苷酶試劑盒（Dualsystems Biotech，Swiss）測定β-半乳糖苷酶活性。

1.5 GmLEA蛋白的亞細(xì)胞定位

通過設(shè)計(jì)的ORF引物，利用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ對pA7空載和目的片段進(jìn)行酶切，并通過酶切重組的方法將目的基因構(gòu)建到pA7-GFP表達(dá)載體上，獲得pA7-GmLEA-GFP重組載體。取葉脈較少的煙草葉片并剪去主脈，葉片背面朝上平貼于MS培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)。使用PDS-1000/He基因槍（Bio-Rad）將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到煙草葉片細(xì)胞中，25℃暗培養(yǎng)16 h，激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP蛋白表達(dá)信號。

1.6 雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)

通過對和的ORF進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，利用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和HⅠ對nE-YFP和cE-YFP 2個(gè)空載和目的片段進(jìn)行酶切，并通過酶切重組的方法將目的基因分別構(gòu)建到nE-YFP和cE-YFP 2個(gè)載體上，共得到nE-GmCDPKSK5和cE-GmLEA 2個(gè)重組載體。采用上述1.5相同的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到煙草葉片細(xì)胞中，25℃暗培養(yǎng)16 h，激光共聚焦顯微鏡下觀察YFP蛋白表達(dá)信號。

1.7 GmLEA的表達(dá)分析

將大豆種子播種于塑料花盆中，每盆約3—5粒種子；并將其置于正常條件下生長。當(dāng)大豆生長至R6與R7之間時(shí)，置于人工氣候培養(yǎng)箱中，模擬田間高溫高濕環(huán)境條件進(jìn)行處理，正常環(huán)境中生長植株為對照。大豆植株正常生長條件與處理?xiàng)l件見表1。在處理期間的0、24、48、96和168 h收集來自處理和對照植物中部的種子。

當(dāng)大豆生長至一節(jié)期（V1）時(shí)，采集大豆植株的子葉、根、莖及葉；花取自其盛花期（R2）；幼莢和幼嫩的豆粒取自盛莢期（R4）；成熟的莢和成熟的豆粒取自完熟期（R8），進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析。

表1 植物生長條件

當(dāng)大豆植株處于盛花期（R2）時(shí)，選取植株上部的花在花柄處掛牌并標(biāo)注日期，從花后15 d開始到花后60 d結(jié)束，每隔5 d取一次樣，收集整個(gè)莢，進(jìn)行種子發(fā)育時(shí)期分析。

所有樣品取樣后立即于液氮中冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩⒄誛ANG等[18]方進(jìn)行法qRT-PCR分析，設(shè)置3次重復(fù)。

1.8 擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因純合植株的獲得

將的ORF區(qū)域構(gòu)建到pBI121-GUS 植物過表達(dá)載體上，該載體主要包括Kan抗性基因、CaMV35S啟動(dòng)子和。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥（WT）。經(jīng)篩選鑒定得到3個(gè)過表達(dá)陽性株系LEA-1、LEA-2和LEA-3，分別收獲純合的T3代過表達(dá)擬南芥種子進(jìn)行功能分析。

1.9 過表達(dá)擬南芥種子生活力與活力指標(biāo)的測定

按表1將WT、pBI121-GUS過表達(dá)和過表達(dá)植株莢黃熟期的植株處理2 d，同時(shí)設(shè)置對照。

待種子收獲后，處理組和對照組各株系擬南芥種子各取100粒，進(jìn)行TTC染色，種胚全部或大部分被染成紅色的為具有生活力的種子，反之為死種子，觀察種子生活力。另外，分別取100粒種子點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上，從播種后的第1天至第5天，每半天記錄一次種子的發(fā)芽數(shù)，稱取第5天擬南芥幼苗重量，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及平均發(fā)芽天數(shù)。

1.10 數(shù)據(jù)處理

使用軟件DPS進(jìn)行方差（ANOVA）分析，檢測差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 GmLEA的分離與進(jìn)化樹分析

以湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 377 bp處有與預(yù)期大小相同的特異性條帶，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)該基因的cDNA序列在2個(gè)品種間沒有差異。以湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到長度為1 879 bp的DNA序列。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，按科分為4大類，分別為豆科（Leguminosae）、蝶形花科（Papilionaceae）、葫蘆科（Cucurbitaceae）和小桿科（Rhabditidae），GmLEA與豆科的LEA蛋白親緣關(guān)系比較近（圖1）。

2.2 GmLEA與GmCDPKSK5的酵母雙雜交驗(yàn)證

由圖2可知，全部質(zhì)粒組合均在SD-TL（SD/-Trp- Leu）培養(yǎng)基上正常生長，說明全部質(zhì)粒組合均成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，只有pNubG-Fe65與pTSU2- APP和pPR3N-GmLEA與pBT3SUC-GmCDPKSK5 2個(gè)質(zhì)粒組合能夠正常生長在SD-TLHA（SD/-Trp-Leu- His-Ade）培養(yǎng)基上且能被X-α-Gal染成藍(lán)色，而其他3個(gè)質(zhì)粒組合的酵母細(xì)胞不能在SD-TLHA培養(yǎng)基上生長，且pPR3N-GmLEA與pBT3SUC-GmCDPKSK5質(zhì)粒組合的β-半乳糖苷酶活性值顯著高于3個(gè)質(zhì)粒組合，表明GmLEA與GmCDPKSK5在酵母體內(nèi)存在特異性互作。

2.3 GmLEA的亞細(xì)胞定位

采用基因槍介導(dǎo)法將融合表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入煙草葉片細(xì)胞中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光位置。發(fā)現(xiàn)pA7-GmLEA-GFP融合蛋白在煙草葉片細(xì)胞細(xì)胞膜上表達(dá)且與膜Marker蛋白pm-ck CD3-1001信號重合，而pA7-GFP空載分布在煙草葉片細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞中（圖3）。結(jié)果表明，GmLEA定位于煙草葉片細(xì)胞膜上。

Gm：大豆Glycine max，NP001238201.1；Gs：野生大豆Glycine max，KHN03228.1；Cc：木豆Cajanus cajan，KYP57744.1；Va：紅豆Vigna angularis，XP017413051.1；Pv：菜豆Phaseolus vulgaris，XP007154470.1；Ts：地三葉草Trifolium subterraneum，GAU16739.1；Mt：蒺藜苜蓿Medicago truncatula，XP003609877.1；Ms：紫花苜蓿Medicago sativa，ACD14089.1；La：狹葉羽扇豆Lupinus angustifolius，OIV95293.1；Cm：甜瓜Cucumis melo，ADN34043.1；Aa：小花南芥Arabis alpina，CCO06495.1；Ce：秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans，NP001256172.1；蝶形花科 Papilionaceae；豆科Leguminous；葫蘆科Cucurbitaceae；小桿科Rhabditidae

圖2 GmLEA與GmCDPKSK5蛋白的酵母雙雜交驗(yàn)證

2.4 BiFC驗(yàn)證GmLEA與GmCDPKSK5互作

采用基因槍介導(dǎo)法將融合表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入煙草葉片細(xì)胞中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光位置。將nEYFP-GmCDPKSK5與cEYFP-GmLEA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入煙草葉片細(xì)胞中，在煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞膜上可觀察到有黃色熒光分布，并且與膜Marker蛋白pm-ck CD3-1001信號重合，而nEYFP與cEYFP-GmLEA、nEYFP-GmCDPKSK5與cEYFP和nEYFP與cEYFP質(zhì)粒組合共轉(zhuǎn)入煙草葉片中沒有觀察到黃色熒光（圖4）。說明GmLEA與GmCDPKSK5蛋白主要在煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞膜上發(fā)生特異性互作。

2.5 GmLEA的組織表達(dá)分析

為了解在大豆不同組織器官的表達(dá)特性，通過qRT-PCR分別檢測了在湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號不同組織器官中的表達(dá)情況。主要在2個(gè)品種發(fā)育中的種子及成熟的種子中表達(dá)，在莢中有少量表達(dá)，在根、莖、葉、花和子葉中幾乎無表達(dá)（圖5）。

圖3 GmLEA在煙草葉肉細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

圖4 GmLEA與GmCDPKSK5蛋白在煙草葉片細(xì)胞中的BiFC驗(yàn)證

2.6 大豆種子發(fā)育過程中GmLEA的表達(dá)特性

通過組織表達(dá)特性分析，發(fā)現(xiàn)在湘 豆2號和寧鎮(zhèn)1號種子中的表達(dá)量很高，進(jìn)一步分析了該基因在2個(gè)品種種子發(fā)育過程中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在湘豆3號種子發(fā)育過程中表達(dá)量先上升后下降，并且在開花后50 d達(dá)到 最大值。在寧鎮(zhèn)1號種子發(fā)育過程中表達(dá)量呈上升的趨勢，并且在開花后60 d達(dá)到最大值（圖6）。結(jié)果表明，可能參與了種子發(fā)育過程。

不同大寫字母表示在P＜0.01水平差異顯著

圖6 大豆種子發(fā)育過程中GmLEA的相對表達(dá)量

2.7 高溫高濕脅迫下GmLEA的表達(dá)特性

大豆植株在種子生理成熟期經(jīng)高溫高濕脅迫處理后，在湘豆3號種子中，僅在96 h下調(diào)表達(dá)，在其余時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)，且在24、48、96和168 h差異達(dá)極顯著（＜0.01）水平；在寧鎮(zhèn)1號種子中，的表達(dá)量僅在24 h低于對照組，在其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均高于對照組，且在48 h和96 h差異達(dá)極顯著（＜0.01）水平（圖7）。結(jié)果表明，響應(yīng)高溫高濕脅迫，并推測其可能參與春大豆種子田間劣變抗性過程。

2.8 高溫高濕脅迫下GmLEA過表達(dá)擬南芥種子的活力分析

通過對種子進(jìn)行高溫高濕脅迫，在正常生長條件下，所有植株的種子在第5天發(fā)芽率均能達(dá)到90%左右，且都能正常生長為幼苗；而經(jīng)高溫高濕脅迫后，各個(gè)株系種子的發(fā)芽率均有所下降，但過表達(dá)植株下降的幅度最小，狀態(tài)要好于其他2個(gè)株系（圖8-A和圖8-B）。TTC染色結(jié)果與種子萌發(fā)的結(jié)果基本一致（圖8-C）。表2顯示高溫高濕脅迫后，過表達(dá)植株、pBI121-GUS過表達(dá)植株與WT植株的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均顯著（＜0.01）低于對照組，但是過表達(dá)植株優(yōu)于（＜0.01）其他2個(gè)株系；而WT、pBI121-GUS過表達(dá)株系和過表達(dá)株系種子的平均發(fā)芽天數(shù)比對照組均有所提高，過表達(dá)植株種子的平均發(fā)芽天數(shù)低于WT、pBI121-GUS過表達(dá)植株。結(jié)果表明，高溫高濕脅迫后過表達(dá)株系的種子活力顯著高于野生型。

A：湘豆3號；B：寧鎮(zhèn)1號。**表示差異極顯著（P＜0.01）

表2 高溫高濕處理對擬南芥種子萌發(fā)特性的影響

同列不同大寫字母表示在＜0.01水平差異顯著

Different capital letters in the same column indicate significant difference at＜0.01 level

A：播種7 d后的經(jīng)高溫高濕處理2 d收獲的野生型和轉(zhuǎn)基因株系幼苗；B：對照條件下與經(jīng)高溫高濕處理的種子發(fā)芽率；C：經(jīng)高溫高濕處理的種子TTC染色，bar=2 mm

3 討論

3.1 GmLEA的表達(dá)分析

LEA蛋白是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的蛋白質(zhì)，它參與植物抵抗脅迫和滲透調(diào)節(jié)等過程，在植物的不同器官中都有LEA蛋白的廣泛分布，不僅在高等植物種子中分布，花粉管和營養(yǎng)組織中也有分布，主要在種子胚胎發(fā)育后期積累[19-21]。有研究表明LEA在種子發(fā)育過程中逐漸積累[22]。本研究中組織特異性表達(dá)結(jié)果顯示在種子中大量表達(dá)，由此推測可能參與種子的發(fā)育；但值得注意的是在寧鎮(zhèn)1號種子發(fā)育該基因表達(dá)低于湘豆3號種子，通過2個(gè)品種中該基因的序列比對，發(fā)現(xiàn)其在2個(gè)品種間沒有差異，因此，推測該基因在2個(gè)品種中差異表達(dá)可能是由于該基因在不同大豆品種的啟動(dòng)子序列或者上游調(diào)控基因的差異造成的，關(guān)于造成該基因轉(zhuǎn)錄模式差異的具體原因尚不明確，還需進(jìn)一步研究中。

3.2 GmLEA參與高溫高濕脅迫反應(yīng)

有研究表明，在干旱脅迫下，植物體內(nèi)的LEA蛋白的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，形成α螺旋結(jié)構(gòu)，可以和膜脂結(jié)合從而阻止水分的進(jìn)一步喪失[23]。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)蠟梅（Link）中過表達(dá)能夠在一定程度上加強(qiáng)過表達(dá)擬南芥對低溫脅迫的抵抗能力。大豆中的2個(gè)LEA蛋白，即GmPM1和GmPM9都可以通過C端的組氨酸與Cu2+和Fe3+結(jié)合，以清除羥基自由基，減少金屬離子的毒害[25]。柑橘中的脫水素Cucor19能夠清除羥基自由基和過氧化氫，一定程度上減輕活性氧自由基對植物造成的傷害[26]。目前關(guān)于LEA蛋白的功能已經(jīng)有許多研究，但是該類蛋白在高溫高濕方面的研究鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)高溫高濕脅迫。此外，高溫高濕脅迫處理后收獲的過表達(dá)植株種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均優(yōu)于WT和pBI121-GUS過表達(dá)植株，且過表達(dá)植株種子的平均發(fā)芽天數(shù)明顯縮短。因此可以推測高溫高濕脅迫后過表達(dá)可以提高擬南芥種子的活力。

3.3 GmLEA與GmCDPKSK5相互作用

據(jù)報(bào)道，許多蛋白質(zhì)已被證明與CDPK蛋白相互作用，并在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。AtCPK10與HSP1相互作用，在調(diào)節(jié)由ABA和鈣離子介導(dǎo)的氣孔運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用[27]。麻浩老師課題組前期研究發(fā)現(xiàn)GmCDPKSK5與高溫高濕脅迫下春大豆種子活力的形成相關(guān)，以GmCDPKSK5為誘餌構(gòu)建高溫高濕脅迫下抗種子田間劣變春大豆種子膜蛋白酵母雙雜交文庫，在細(xì)胞膜上初步篩選到6個(gè)與之互作的蛋白，分別為1個(gè)LEA蛋白、1個(gè)翻譯控制腫瘤蛋白、1個(gè)種子成熟蛋白、1個(gè)微粒體油酸脫氫酶以及2個(gè)未知功能蛋白[28]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GmCDPKSK5與GmTCTP相互作用并在植物響應(yīng)高溫高濕脅迫中發(fā)揮重要作用[18]。在本研究中，通過酵母雙雜交試驗(yàn)驗(yàn)證了GmLEA與GmCDPKSK5在酵母體內(nèi)存在特異性互作；又通過BiFC試驗(yàn)對GmLEA與GmCDPKSK5的互作進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞膜上發(fā)生特異性互作。

有趣的是，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期對的研究結(jié)果[1]，發(fā)現(xiàn)高溫高濕脅迫后無論是還是都能夠響應(yīng)高溫高濕的脅迫，而且表達(dá)趨勢基本上一致。這種現(xiàn)象一種可能的解釋就是GmLEA與GmCDPKSK5相互作用共同響應(yīng)大豆種子發(fā)育過程中的高溫高濕脅迫。

基于以上結(jié)果，推測GmLEA和GmCDPKSK5相互作用共同對高溫高濕脅迫應(yīng)激反應(yīng)，但是GmLEA和GmCDPKSK5如何參與響應(yīng)高溫高濕脅迫的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從大豆中擴(kuò)增獲得，其cDNA全長1 377 bp，DNA序列全長1 879 bp，由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成。GmLEA蛋白定位于煙草葉片細(xì)胞膜上，與GmCDPKSK5在細(xì)胞膜上特異性互作。具有組織特異性表達(dá)，在大豆種子中表達(dá)量最高；過表達(dá)能夠提高擬南芥種子的活力。

[1] 王爽. 高溫高濕下大豆鈣依賴蛋白激酶基因在種子活力中的功能分析[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

WANG S. Function analysis of soybean [(L.) Merr.]genes on seed vigor under high temperature and humidity[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[2] 劉毓俠, 王鐵固. 種子活力研究進(jìn)展. 玉米科學(xué), 2012, 20(4): 90-94.

LIU Y X, WANG T G. Research progress on seed vigor., 2012, 20(4): 90-94. (in Chinese)

[3] 唐桂香, 汪自強(qiáng). 春播和秋播對南方春大豆種子活力的影響. 作物學(xué)報(bào), 1998, 24(2): 243-247.

TANG G X, WANG Z Q. Effects of spring and autumn sowing on seed vigor of spring soybean in South China., 1998, 24(2): 243-247. (in Chinese)

[4] 趙欣欣, 宋麗榮, 權(quán)薇竹. 高溫高濕老化處理對不同豆類種子活力及生長能力的影響. 作物雜志, 2017(5): 168-172.

ZHAO X X, SONG L R, QUAN W Z. Effects of high temperature and high humidity aging on the vigor and growth capability of different beans., 2017(5): 168-172. (in Chinese)

[5] 王芳, 王麗群, 田鑫, 顧衛(wèi)紅, 麻浩. 中國南方春大豆收獲前后種子劣變的抗性研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 40(11): 2637-2647.

Wang F, Wang L Q, Tian X, Gu W H, MA H. Pre-harvest and post-harvest seed deterioration resistance of spring soybean germplasm in south China., 2007, 40(11): 2637-2647. (in Chinese)

[6] 壽惠霞, 宋文堅(jiān), 張剛, 王文杰. 栽培與野生大豆資源抗種子劣變性差異的研究. 大豆科學(xué), 1998(2): 59-64.

SHOU H X, SONG W J, ZHANG G, WANG W J. Study on the difference of anti-seed degradation of cultivated and wild soybean resources., 1998(2): 59-64. (in Chinese)

[7] 壽惠霞, 宋文堅(jiān). 大豆種子抗劣變性的鑒定方法研究. 種子, 1999, 101(2): 3-5.

SHOU W X, SONG W J. Study on identification method of soybean seed degradation resistance., 1999, 101(2): 3-5. (in Chinese)

[8] 唐善德. 大豆種子劣變研究概況. 種子, 1992, 59(3): 43-45.

TANG S D. Research progress of soybean seed deterioration., 1992, 59(3): 43-45. (in Chinese)

[9] Egli D B, TeKrony D M, Heitholt J J, RUPE J. Air temperature during seed filling and soybean seed germination and vigor., 2005, 45(4): 1329-1335.

[10] Saha R R, Sultana W. Influence of seed ageing on growth and yield of soybean., 2008, 37(1): 21-26.

[11] 李靈芝, 王麗娜, 劉志強(qiáng), 耿香利, 張京慧. 貯藏時(shí)間對大豆種子活力和若干性狀的影響. 中國油料作物學(xué)報(bào), 2003, 25(2): 25-28.

LI L Z, WANG L N, LIU Z Q, GENG X L, ZHANG J H. Effects of storage time on seed vigor and some characters of soybean., 2003, 25(2): 25-28. (in Chinese)

[12] 唐善德, 黃敏珍, 成金蓮. 春大豆種子劣變的研究. 大豆科學(xué), 1994, 13(3): 230-236.

TANG S D, HUANG M Z, CHENG J L. Study on the deterioration of spring soybean seeds., 1994, 13(3): 230-236. (in Chinese)

[13] 宋利茹, 王爽, 牛娟, 馬洪雨, 舒英杰, 楊艷, 顧衛(wèi)紅, 麻浩. 春大豆種子田間劣變性和劣變抗性的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(1): 23-32.

SONG L R, WANG S, NIU J, MA H Y, SHU Y J, YANG Y, GU W H, MA H. Differential proteomics study on degeneration and deterioration resistance of spring soybean seeds., 2015, 48(1): 23-32. (in Chinese)

[14] BATTAGLIA M, COVARRUBIAS A A. Late embryogenesis abundant (LEA) proteins in legumes., 2013, 4: 190.

[15] OLVERA-CARRILLO Y, LUIS REYES J, COVARRUBIAS A A. Late embryogenesis abundant proteins: versatile players in the plant adaptation to water limiting environments., 2011, 6(4): 586-589.

[16] 王艷蓉, 張治國, 吳金霞. LEA蛋白及其在植物抗逆改良中的應(yīng)用. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 3: 1-9.

WANG Y R, ZHANG Z G, WU J X. LEA protein and its application in plant resistance improvement., 2015, 3: 1-9. (in Chinese)

[17] 劉露露, 陳雷, 張春艷, 石瑞杰, 任江萍, 孟凡榮, 尹鈞, 李永春. 兩個(gè)小麥基因的特征及其對非生物脅迫的響應(yīng). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(19): 3736-3745.

LIU L L, CHEN L, ZHANG C Y, SHI R J, REN J P, MENG F R, YIN J, LI Y C. Characteristics of two wheatgenes and their responses to abiotic stress., 2014, 47(19): 3736-3745. (in Chinese)

[18] WANG S, TAO Y, ZHOU Y L, NIU J, SHU Y J, YU X W, LIU S S, CHEN M, GU W H, MA H. Translationally controlled tumor protein GmTCTP interacts with GmCDPKSK5 in response to high temperature and humidity stress during soybean seed development., 2017, 82(1): 187-200.

[19] SWIRE-CLARK G A, MARCOTTE W R. The wheat LEA protein Em functions as an osmoprotective molecule in., 1999, 39(1): 117-128.

[20] 張林生, 趙文明. LEA蛋白與植物的抗旱性. 植物生理學(xué)通訊, 2003, 39(1): 61-66.

ZHANG L S, ZHAO W M. LEA protein and drought resistance of plants., 2003, 39(1): 61-66. (in Chinese)

[21] 李樂, 許紅亮, 楊興露. 大豆基因家族全基因組鑒定、分類和表達(dá). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(19): 3945-3954.

LI L, XU H L, YANG X L. Whole genome identification, classification and expression of soybeangene family., 2011, 44(19): 3945-3954. (in Chinese)

[22] BATTAGLIA M, OLVERA-CARRILLO Y, GARCIARRUBIO A, CAMPOS F, COVARRUBIAS A A. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins., 2008, 148(1): 6-24.

[23] 李翔. 植物基因家族的分子進(jìn)化研究和一擬南芥非典型基因功能的初步分析[D]. 南京: 江蘇大學(xué), 2016.

LI X. Molecular evolutionary research of the plantgene family and preliminary functional analysis of an atypicalgene in[D]. Nanjing: Jiangsu University, 2016. (in Chinese)

[24] LIU Y, XIE L, LIANG X, ZHANG S H., the late embryogenesis abundant protein gene from, possesses low temperature and osmotic resistances in prokaryote and eukaryotes., 2015, 16(11): 26978-26990.

[25] LIU G, XU H, ZHANG L, ZHENG Y. Fe binding properties of two soybean (L.) LEA4 proteins associated with antioxidant activity., 2011, 52(6): 994-1002.

[26] HARA M, FUJINAGA M, KUBOI T. Radical scavenging activity and oxidative modification of citrus dehydrin., 2004, 42(7/8): 657-662．

[27] ZOU J J, WEI F J, WANG C, WU J J, LIU W X, WU W H.calcium-dependent protein kinase CPK10 functions in abscisic acid- and Ca2+-mediated stomatal regulation in response to drought stress., 2010, 154(3): 1232-1243.

[28] 麻浩, 王爽, 周亞麗. 植物中鈣依賴蛋白激酶的研究進(jìn)展. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 40(4): 565-572.

MA H, WANG S, ZHOU Y L. Research progress of calcium- dependent protein kinases in plants., 2017, 40(4): 565-572. (in Chinese)

Isolation and Functional analysis of soybeanin seed vigor

ZHOU YaLi, ZHU YaJing, ZHAO FeiYun, WANG Shuang, LIU SuShuang, GUO LingKai, ZHAO HaiHong, MA Hao

(National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)

【Objective】Soybean((L.) Merr.) seed generally form vitality from their physiological maturity period(R6 or R7 period). However, the seed is susceptible to high temperature and humidity (HTH) stress during this period. This will lead to a decline in seed vigor. The results will lay a foundation for further studying the mechanism of seed vigor formation under abiotic stress. 【Method】Primer Premier 5.0 was used to design primers, and the full length cDNA sequence ofwas isolated by using the cDNA of leaves of cv. Ningzhen No.1 and Xiangdou No.3 as template. The homologous amino acid sequence of GmLEA was searched by BLAST at NCBI, the protein sequences were multiple aligned using MEGA 6.0 and DNAMAN, and the phylogenetic tree was constructed using the N-J algorithm of MEGA 6.0. Yeast two-hybrid experiments were performed to verify the interaction of GmLEA and GmCDPKSK5 in yeast. A subcellular localization and bimolecular fluorescent complementation (BiFC) vector were constructed, The interaction between GmLEA and GmCDPKSK5 in tobacco leaf cells and the subcellular localization of the encoded protein were analyzed by gene-gun-mediated transformation of tobacco leaves. In addition, the tissue-specific expression ofgene and the expression pattern ofgene under HTH were analyzed by qRT-PCR, respectively. The pBI121 fusion expression vector was constructed and three homozygous overexpressedlines were obtained through Agrobacterium- mediated method, and three independent homozygous T3transgenic lines were used for analysis. 【Result】The cDNA sequence ofgene contains a 1 377 bp open reading frame (ORF), and the subcellular localization result showed that the encoded protein was located on the cell membrane. The results of yeast two-hybrid rotation verification showed that GmLEA could interact with GmCDPKSK5 in yeast. In addition, bimolecular fluorescence complementation (BiFC) experiment showed that GmLEA could interact with GmCDPKSK5 on cell membrane of tobacco leaf cells. The results of tissue-specific analysis showed thatgene had higher expression levels in developing and mature seeds of both cultivars. The expression level ofwas increased first and then decreased during the development of cv. Xiangdou No. 3 seeds. During the process of seed development of cv. Ningzhen No.1, the level ofexpression was on the rise and reached the highest at 60 days after flowering. After high temperature and high humidity (HTH) stress, the expression ofwas decreased at 96 h in cv. Xiangdou No. 3, and the other time points were increased. However, the expression was decreased at 24 h in cv. Ningzhen No.1. The germination potential, germination rate and seed vigor ofgene in transgenicthaliana were significantly (＜0.01) higher than those of the wild type plants under HTH stress. 【Conclusion】Theis involved in the formation of seed vigor under HTH stress，and has specific interaction with GmCDPKSK5, It is speculated that they may participate in the formation of seed vigor under HTH stress.

soybean;;; high temperature and high humidity stress; seed vigor

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.23.001

2018-06-22；

2018-07-29

國家自然科學(xué)基金（31671772，31371711）、科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0100905）

周亞麗，Tel：15062270213；E-mail：807834731@qq.com。

麻浩，Tel：025-84395324；E-mail：Lq-ncsi@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）