冷卻速率對洋蔥內表皮細胞結構的影響

(天津商業大學 天津市制冷技術重點實驗室 天津 300134)

現代社會飛速發展，生活水平不斷提高，人們對食品營養品質的關注度逐步提升[1]。我國初級果蔬產品占比達90%，而采摘后損失率達25%～30%[2-3]。冷凍冷藏可以更好的保存食品品質。M. Fuchigami等[4-5]通過對胡蘿卜進行冷卻-復溫，發現冷凍會影響細胞的結構和質地。T. Acharya等[6]利用低溫顯微鏡研究了細胞滲透特性在冷卻過程中的變化規律。但并不知曉冷卻過程中，細胞內冰晶的生長過程。

Li Wei等[7]對細胞的凍存進行了研究，并模擬了胞內冰的生長過程。為了更真實的觀察細胞內冰晶的生長情況，T. Ninagawa等[8]利用高速攝像機，觀測了不同冷卻速率下草莓天竺葵的葉子細胞內冰晶生長過程，發現不同冷卻速率會影響冰晶生長方式及冰晶的大小。細胞組織的力學性能和形態參數對研究細胞結構和質地的變化至關重要。J. J. Ordaz-Ortiz等[9]使用拉伸方法測試了番茄組織強度，通過低溫掃描電鏡判定組織破壞機制。M. C. Alamar等[10]測定了不同品種和不同貯存條件下的蘋果組織的力學性能和形態參數。婁耀郟[11]研究了弱強度的靜磁場對食品冷凍的影響及其影響機理。宋健飛等[12]研究了直流磁場對洋蔥細胞凍結過程的影響。

以上學者對植物細胞的冷凍過程、冰晶生長及生物組織的破壞機制進行了大量研究，然而，關于植物細胞在冷驅動下的力學特性研究較少。由于洋蔥的內表皮細胞較大且規則，易于觀察，因此，本文選取洋蔥內表皮細胞為研究對象，利用低溫顯微鏡，對細胞的冷卻-復溫過程進行觀察，分析細胞在不同冷卻速率下冰晶的大小及復溫后細胞的形變，研究冷卻速率的影響特性及細胞冷卻過程中的結構變化。

1 實驗裝置及方法

1.1 實驗臺

實驗采用低溫顯微鏡系統，其溫度控制范圍為-196～125 ℃，熱電偶為A級Pt100鉑電阻，精度為±0.01 ℃，溫度響應時間小于0.01 s，可實現迅速降溫和精確控制。采用循環氮氣吹掃冷臺鏡，防止鏡口處形成濕氣凝結，影響顯微鏡觀測。

1.2 實驗材料及方法

實驗選用市場銷售的洋蔥作為取樣對象，其大小均勻、成熟度一致、無病蟲及損傷。實驗步驟：1)取洋蔥內表皮長寬為10 mm×10 mm，其厚度多次測量取均值為0.115 6 mm；2)將洋蔥內表皮細胞置于載玻片，保證平整無氣泡；3)將玻片置于低溫顯微鏡中的樣品池中，調至清晰；4)設置冷卻速率為2、6、8、12、15、20、50、90 ℃/min，由常溫降至結晶點并維持5 min，再以速率10 ℃/min復溫至常溫，拍照時間為1 張/s；5)利用Image-Pro Plus軟件，對洋蔥內表皮細胞的顯微照片(放大至200倍)進行定量分析，記錄細胞結晶溫度和結晶所需要的時間。

2 實驗結果

對不同冷卻速率下洋蔥內表皮細胞進行動態觀察，得到細胞結晶溫度、結晶時間及細胞外觀形態的變化。結果表明，不同冷卻速率下，細胞結構的變化趨勢相同。以冷卻速率為12 ℃/min的冷卻過程為例，圖1所示為洋蔥內表皮細胞顯微圖片，隨著溫度的降低，細胞明顯變得褶皺，細胞間隙逐漸形成冰晶，溫度繼續下降，直至細胞完全結晶。

圖2 洋蔥內表皮細胞時結晶照片與3D光強度圖Fig.2 Onion epidermal cell images at the moment of crystallization and 3D light intensity with different cooling rates

2.1 胞內冰晶對細胞損傷的分析

透光強度可反映胞內冰晶的形成情況。圖2所示為選取不同冷卻速率下細胞結晶時的照片和通過Image-Pro Plus軟件進行處理得到的細胞結晶時的3D光強度圖。淺色部分代表透過細胞的光，可以看到冷卻速率從2 ℃/min升至90 ℃/min的過程中，淺色對應的分布區域越來越稀少，與之對應的結晶時的照片顯示越來越暗。圖3所示為洋蔥內表皮細胞結晶時的平均灰度值。由圖3可知，冷卻速率為2 ℃/min 時照片的平均灰度值為44.11%；2～15 ℃/min時平均灰度值下降了27.5%；2～90 ℃/min時平均灰度值下降了37.2%。

圖3 洋蔥內表皮細胞結晶時的平均灰度值Fig.3 Relationship between the cooling rate and the average gravy value

這說明冷卻速率的快慢，對冰晶的生長產生了影響。當冷卻速率較慢時，冰晶生長過程較為穩定，細胞內不易形成晶核，因此晶核的數量較少。冰晶在生長過程中受到其它冰晶的干擾較弱，形成的枝晶粗大且數量少，散射能力弱，透光能力強。當冷卻速率升高時，冰晶形成過程的穩定程度下降，不僅細胞內形成的晶核變多，而且各個晶核在冰晶在生長過程中還會相互干擾，導致生長出的冰晶較為混亂，形成的枝晶小且數量多，散射能力強，因此細胞的透光能力下降。顯然，當細胞內形成的冰晶較大時，會對細胞造成更大的機械損傷。

2.2 細胞形變的分析

有些文獻中采用長短軸之比研究細胞的形變，其值雖然可以反映細胞的形變，但內因無從得知。假設細胞所受載荷是均勻的，細胞形變與細胞內壓的變化相關聯，因此本文在分析細胞形變時采用如下計算式[13]：

(1)

但此公式適用于圓形細胞，本實驗選取的洋蔥內表皮細胞為較為規則的矩形細胞。故用當量直徑代替式(1)中的半徑，可得式(2)：

(2)

細胞的面積及周長可通過Image-Pro Plus軟件測量，洋蔥表皮細胞的當量直徑可由式(3)計算：

(3)

細胞的體積變化可由式(4)計算：

ΔV=V-V0

(4)

式中：γ為細胞壁的泊松比[14]，γ=0.33[14]；E為細胞壁的彈性模量，E=2.67×107N/m2；h為細胞壁的厚度，h=0.125×10-5m；L為細胞的周長，m；S為細胞的面積，m2；D0為細胞初始的當量直徑，m；Di為細胞變形后的當量直徑，m；R、r分別為細胞的直徑和半徑，m；V0、V分別為細胞初始和變化后體積，ΔV為細胞體積的變化，m3。

圖4所示為不同冷卻速率下體積與內壓的變化。由圖4可知，冷卻過程中，從20 ℃降至4 ℃左右時，細胞內壓增大；從4 ℃降至0 ℃時，內壓略有減小；0 ℃之后，內壓繼續增大，直至細胞完全結晶。而體積的變化與內壓變化趨勢相反。當溫度高于0 ℃時，細胞的體積在4 ℃附近出現最小值，這是因為水的密度在4 ℃時最小，隨著溫度繼續降低，水的體積逐漸增大。當溫度低于0 ℃時，細胞間隙逐漸形成冰晶，擠壓細胞，并伴隨著細胞水分外流，導致細胞體積減小，直到細胞完全凍結。

由圖4還可以發現，復溫過程與冷卻過程類似，但當溫度恢復至室溫后，細胞的體積不會完全恢復。因此，無論冷卻速率多大，均會對細胞產生影響，并且這種影響只能降低，不可避免。該影響與細胞內壓的變化有緊密的聯系。細胞內壓的變化會對細胞形狀產生直接影響。內壓增大，體積減小，使其形狀發生改變，當達到細胞的屈服極限時，細胞結構便會發生變化，致使細胞死亡。而且冷卻速率越慢，這種影響越明顯，與2.1節的結論一致。當冷卻速率為2 ℃/min時，冷卻-復溫過程結束后，細胞內壓增大了0.388×10-2Pa，體積減小了2.264×10-13m3。

圖4 不同冷卻速率下體積與內壓的變化Fig.4 The volume and internal pressure vary with the temperature at different cooling rates

圖5所示為冷卻速率為2 ℃/min時洋蔥內表皮細胞圖像。對比圖5(a)與(b)可知，復溫后細胞結構發生了明顯變化。

圖5 冷卻速率為2 ℃/min時洋蔥內表皮細胞圖像Fig.5 Pictures of cells in original state and after rewarming at cooling rate of 2 ℃/min

2.3 過冷度與結晶時間、細胞體積變化的關系

利用低溫顯微鏡對不同冷卻速率下的洋蔥內表皮細胞進行觀察，得到細胞結晶所需時間與結晶溫度。結晶時間是指從初始狀態至細胞完全結晶的時間。結晶溫度為細胞完全結晶時的溫度，將結晶溫度轉換為過冷度[14]，即：

ΔT=Tz-Ti

(5)

為了對比不同冷卻速率對細胞形變的影響，利用式(6)計算細胞的相對體積變化[15-16]：

(6)

式中：ΔT為過冷度，℃；Tz為液體的凝固點，取0 ℃；Ti為細胞結晶時的溫度，℃；VR為細胞冷卻-復溫前后的相對體積變化，%。

圖6所示為冷卻速率對過冷度、結晶時間、VR的影響。由圖6可知，相對體積變化、結晶時間及過冷度在冷卻速率為2～20 ℃/min時，變化較為劇烈，其中結晶時間縮短了86.45%，過冷度增加了7.5 ℃，VR由9.7%減小為3.05%。當冷卻速率大于20 ℃/min后，三者的變化趨勢變緩，直至90 ℃/min時，結晶時間縮短了32.89%，過冷度增大了7 ℃，結晶時VR由3.05%減小為2.45%。

圖6 冷卻速率對過冷度、結晶時間、相對體積變化的影響Fig.6 Effect of cooling rate on supercooling degree, crystallization time, and relative volume change

這是由于細胞間隙溶液濃度相對較小，當冷卻速率較小時，細胞間隙處首先發生結晶現象，細胞外溶液濃度增高，細胞內水分發生遷移至細胞間隙。細胞間隙吸收水分的同時也在進行結晶，并釋放潛熱。而且冷卻速率越慢，流向細胞間隙的水分越多，細胞間隙形成的冰晶越大，細胞結晶時的變形量越大，復溫后細胞的變形量也越明顯。當冷卻至一定溫度時，細胞內水分的化學鍵不再穩定，瞬間結晶，釋放潛熱。

當冷卻速率較大時，短時間提供給細胞的冷量較多，溫度下降較快，細胞間隙溶液迅速凍結，細胞內的水分來不及外流。因此結晶所需的過冷度較大，在結晶瞬間釋放大量潛熱。并且細胞間隙形成的冰晶較小，導致結晶后細胞變形量較小。當冷卻過程中細胞的變形量較小時，恢復至室溫后，細胞的變形量也隨之減小。90 ℃/min時，冷卻-復溫結束后，VR僅為1.24%。因此冷卻速率越大，過冷度越大，結晶時間越短，對細胞體積的影響也越小。而此時細胞能夠恢復至初始狀態的能力較強，最終對細胞造成的損傷較小。

3 結論

本文將洋蔥內表皮細胞分別在2、6、8、12、15、20、50、90 ℃/min的冷卻速率下進行冷卻-復溫，對細胞冷凍過程的變化規律及冰晶對細胞的影響進行了研究，得出以下結論：

1)冷卻速率較低時，細胞透光能力強。冷卻速率為2 ℃/min時平均灰度值達到44.11%，冷卻速率為2～90 ℃/min的平均灰度值下降37.2%。此時形成的冰晶雖然數量較少，但體積較大，對細胞造成的機械損傷更大。

2)不同冷卻速率下，細胞體積與內壓的變化不同，但整體趨勢相同。細胞體積隨冷卻溫度的下降，整體呈下降趨勢，復溫過程細胞體積變化規律與冷卻過程相反。但體積變化在4 ℃附近出現突變，這是由于水在4 ℃時的密度最小。細胞體積與內壓變化趨勢相反。

3)細胞經歷冷卻-復溫過程后，細胞的結構形狀發生了不可逆變化，但在較高的冷卻速率時其體積變化不明顯。當冷卻速率為90 ℃/min時，相對體積變化量僅為1.24%。

本文受天津市自然科學基金項目(16JCQNJC14000)資助。(The project was supported by the Natural Science Foundation of Tianjin (No.16JCQNJC14000).)