復合酶和超聲輔助兩步法提取甘草酸的工藝

梁 霞 呂曉玲

LIANG Xia LU Xiao-ling

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

(School of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

甘草屬于豆科植物，主要生長在歐洲和亞洲南部。甘草中含有甘草酸、多糖、類黃酮等許多活性成分，其中，最重要的活性成分之一是甘草酸(Glycyrrhizic Acid，GL)。甘草酸的甜度大約是蔗糖的200倍，且熱量低，安全無毒，其甜味可在口腔中保持較長時間，是理想的天然甜味劑，已被廣泛應用于食品工業。此外，由于甘草酸具有抗病毒、抗氧化、抗癌等特性，已被廣泛應用于醫藥等行業[1-2]。

從甘草中提取甘草酸是分離得到甘草酸的先導步驟。目前已報道[3-6]的甘草酸提取方法主要有傳統提取法和現代提取法。傳統提取法主要包括水提法、有機溶劑提取法和索氏提取法等，這些方法存在操作時間長、甘草酸提取率低、有機溶劑回收困難進而污染環境等缺點。現代提取法主要包括酶提取法、超聲波提取法、微波提取法等，這些方法相比傳統提取方法提取率有所提高，但僅使用其中一種方法耗費的時間仍較長，能耗較大。近年來，采用兩種方法兩步提取植物中有效成分的研究逐漸成為熱門課題。龍佳朋等[7]研究了復合酶法、氨性乙醇浸提法兩步提取甘草酸的工藝，結果顯示，復合酶法、氨性乙醇浸提法兩步提取甘草酸的總操作時間為3.5 h，最終得到甘草酸的提取率僅85.02%。為改善現有甘草酸提取方法的操作時間長、提取率低等不足，本研究擬結合復合酶法的條件溫和、環保優勢與超聲法的高效優勢，采用復合酶和超聲輔助兩步法提取甘草中的甘草酸，探求其最佳工藝條件。旨在為甘草酸的提取研究提供新方法、新思路，為甘草酸的實際提取應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

甘草酸對照品：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

烏拉爾甘草：廣東天誠中藥飲片有限公司；

纖維素酶：活力≥1×104U/g，北京鼎國生物技術有限公司；

果膠酶：活力1×104U/g，南寧東恒華道生物技術有限責任公司。

1.1.2 主要儀器設備

數控超聲波清洗器：KQ-500DE型,昆山市超聲儀器有限公司；

高效液相色譜儀(UV檢測器)：LC-20A型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 甘草酸的測定方法 采用高效液相色譜法。參考文獻[8]修改如下,色譜條件：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A：0.1%磷酸—水，流動相B：乙腈；檢測波長：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL；梯度洗脫參數如表1所示。

表1 高效液相色譜梯度洗脫參數

1.2.2 標準曲線的繪制 分別精密稱取甘草酸對照品1，2，3，4，5，6 mg于100 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解，定容，搖勻，取適量過0.45 μm有機濾膜，按1.2.1方法測其峰面積。以各甘草酸對照品溶液的濃度C為橫坐標，對應的峰面積值S為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：S=1E+07C+14 947，相關系數R2=1.000 0，表明該標準曲線在濃度為0.01～0.06 mg/mL時呈線性關系。

1.2.3 甘草原料中甘草酸總含量的測定 參考文獻[9]修改如下：將甘草原料粉碎，過三號篩(50目)，干燥至恒重，精密稱取0.2 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，在功率為250 W，頻率為40 kHz的條件下超聲處理30 min，冷卻，再稱定重量，用70%乙醇補足減少的重量，搖勻，4 700 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀再按上述藥典方法重復提取4次后，棄沉淀，合并5次提取所得上清液，并按1.2.1方法測其峰面積值，按式(1)計算甘草原料中總甘草酸含量。

(1)

式中：

P——原料中甘草酸含量，%；

C——甘草酸濃度，mg/mL；

V——甘草酸提取液體積，mL；

m——原料質量，g。

1.2.4 復合酶法提取階段的工藝流程及操作要點

工藝流程：甘草→粉碎→過篩→干燥→復合酶法提取→滅酶→離心→甘草酸提取液

操作要點：

(1) 過篩：將粉碎后的甘草粉末分別過20，40，60，80目篩。

(2) 干燥：需將過篩后的甘草粉末干燥至恒重。

(3) 復合酶法提取：用pH為4.5的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液分別配制酶活均為100 U/mL果膠酶溶液和纖維素酶溶液；精密稱取1 g甘草粉末于250 mL具塞錐形瓶中，按設定量加入提取液(磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液)和纖維素酶、果膠酶溶液，于設定溫度的恒溫水浴鍋中提取甘草酸。

(4) 滅酶：酶解完成后，沸水滅酶10 min。

(5) 離心：冷卻，搖勻后，4 700 r/min離心10 min。

1.2.5 甘草酸提取率的計算 取適量甘草酸提取液，測定甘草酸濃度，按式(2)計算甘草酸提取率。

(2)

式中：

R——甘草酸提取率，%；

n——稀釋倍數；

C——甘草酸濃度，mg/mL；

V——甘草酸提取液體積，mL；

m——原料質量，g；

P——原料中甘草酸總含量，%。

1.2.6 復合酶法提取階段的單因素試驗設計

(1) 復合酶比例：固定加酶量70 U/g·底物、pH 4.5、酶解時間1.5 h、酶解溫度45 ℃、甘草粒度40目、料液比1∶25(g/mL)，研究復合酶比例[果膠酶∶纖維素酶為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6 (U/U)]對甘草酸提取率的影響。

(2) 加酶量：固定復合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3 (U/U)、pH 4.5、時間1.5 h、溫度45 ℃、甘草粒度40目、料液比1∶25 (g/mL)，研究加酶量(35，70，105，140，175，210，245 U/g·底物)對甘草酸提取率的影響。

(3) pH：固定復合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3 (U/U)、加酶量70 U/g·底物、時間1.5 h、溫度45 ℃、甘草粒度40目、料液比1∶25 (g/mL)，研究pH(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)對甘草酸提取率的影響。

(4) 酶解時間：固定復合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3(U/U)、加酶量70 U/g·底物、pH 4.5、溫度45 ℃、甘草粒度40目、料液比1∶25 (g/mL)，研究酶解時間(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)對甘草酸提取率的影響。

(5) 溫度：固定復合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3(U/U)、加酶量70 U/g·底物、pH 4.5、時間1.5 h、甘草粒度40目、料液比1∶25 (g/mL)，研究溫度(35，40，45，50，55，60 ℃)對甘草酸提取率的影響。

(6) 原料粒度：固定復合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3(U/U)、加酶量70 U/g·底物、pH 4.5、時間1.5 h、溫度45 ℃、料液比1∶25 (g/mL)，研究原料粒度(20，40，60，80目)對甘草酸提取率的影響。

(7) 料液比：固定復合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3 (U/U)、加酶量70 U/g·底物、pH 4.5、時間1.5 h、溫度45 ℃、甘草粒度40目，研究料液比[1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35 (g/mL)]對甘草酸提取率的影響。

1.2.7 復合酶法提取階段的工藝優化 以單因素研究為參考，在最優復合酶比例、pH和料液比的條件下，根據響應面法(Response Surface Method，RSM)優化設計原理，選擇Box-Benhnken設計方法，以加酶量、酶解時間、酶解溫度、原料粒度為自變量，甘草酸提取率為響應值，建立四因素三水平RSM分析試驗。

1.2.8 超聲輔助提取階段的工藝流程及操作要點

工藝流程：復合酶法提取→滅酶→冷卻→加入70%乙醇→超聲法提取→離心→甘草酸提取液

操作要點：

(1) 復合酶法提取：按1.2.7最佳條件進行甘草酸的提取。

(2) 加入70%乙醇：通過濃縮或補加相同緩沖液使滅酶冷卻后的提取液至一定體積，再加入一定量70%乙醇，使最終提取體系中的料液比及乙醇濃度至設定值。

1.2.9 超聲輔助提取階段的單因素試驗設計

(1) 乙醇濃度：固定料液比1∶35 (g/mL)、超聲功率300 W、超聲時間15 min、超聲溫度40 ℃，研究乙醇濃度(11%，14%，17%，20%，23%，26%)對甘草酸提取率的影響。

(2) 料液比：固定提取溶劑為20%乙醇、超聲功率300 W、超聲時間15 min、超聲溫度40 ℃，研究料液比[1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45 (g/mL)]對甘草酸提取率的影響。

(3) 超聲功率：固定提取溶劑為20%乙醇、料液比1∶35(g/mL)、超聲時間15 min、超聲溫度40 ℃，研究超聲功率(200，250，300，350，400 W)對甘草酸提取率的影響。

(4) 超聲時間：固定提取溶劑為20%乙醇、料液比1∶35(g/mL)、超聲功率300 W、超聲溫度40 ℃，研究超聲時間(5，10，15，20，25，30 min)對甘草酸提取率的影響。

(5) 超聲溫度：固定提取溶劑為20%乙醇、料液比1∶35(g/mL)、超聲功率300 W、超聲時間15 min，研究超聲溫度(30，35，40，45，50 ℃)對甘草酸提取率的影響。

2 結果與分析

2.1 甘草原料中總甘草酸的含量

參照《藥典2010》從原料中提取甘草酸5次，可基本將甘草酸完全提出。計算得原料中總甘草酸含量為3.72%。

2.2 復合酶法提取階段的單因素試驗

2.2.1 復合酶比例對甘草酸提取率的影響 在復合酶總量一定時，隨著復合酶比例變化，纖維素酶量增加，果膠酶量減少，甘草酸提取率呈先增加后減小趨勢，見圖1。這是由于甘草細胞壁中纖維素多于果膠，破壁時所需纖維素酶量大于果膠酶量，故隨著纖維素酶的增加甘草酸提取率增大，而果膠酶量過少時，會導致復合酶破壁能力減弱，使甘草酸溶出量減少，提取率下降[10]。在復合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)為1∶3 (U/U)時，甘草酸提取率達到最大。所以最佳復合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)為1∶3 (U/U)。

圖1 復合酶比例對甘草酸提取率的影響

Figure 1 Effect of the ratio of combined enzymes on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.2.2 加酶量對甘草酸提取率的影響 如圖2所示，當加酶量<175 U/g·底物時，隨復合酶量的增加，提取率逐漸升高；當加酶量>175 U/g·底物時，復合酶過量，進而導致復合酶相互附著[11]，酶與底物傳質效率降低，甘草酸提取率下降；當加酶量為175 U/g·底物時，甘草酸提取率達到最大。因此，最佳復合酶量為175 U/g·底物。

圖2 加酶量對甘草酸提取率的影響

Figure 2 Effect of enzyme concentration on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.2.3 酶解pH對甘草酸提取率的影響 當pH<5.5時，隨著pH的增大，復合酶活性升高，破壁能力加強，甘草酸提取率增加；當pH>5.5時，復合酶活性下降，甘草酸提取率下降[12]；當pH為5.5時，甘草酸提取率達到最大，見圖3。因此，最佳pH為5.5。

2.2.4 酶解時間對甘草酸提取率的影響 當酶解時間<1 h時，酶解反應不完全，甘草酸提取率隨時間的延長呈上升趨勢；當反應時間>1 h時，隨著酶解時間延長，甘草酸溶出量逐步減少，甘草酸提取率增加不明顯[12]；當酶解時間為1 h時，甘草酸提取率達到最大，見圖4。綜合考慮，選擇1 h為最佳酶解時間。

2.2.5 酶解溫度對甘草酸提取率的影響 當溫度<50 ℃時，隨溫度的上升，復合酶活性增加，破壁能力加強，甘草酸提取率升高；當溫度>50 ℃時，較高溫度使復合酶活性降低，破壁能力減弱，進而甘草酸提取率下降[13]，當溫度為50 ℃ 時，甘草酸提取率達到最大，見圖5。因此，最佳酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解pH對甘草酸提取率的影響

圖4 酶解時間對甘草酸提取率的影響

Figure 4 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction rate of glycyrrhizic acid

圖5 酶解溫度對甘草酸提取率的影響

Figure 5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.2.6 原料粒度對甘草酸提取率的影響 當原料粒度<40目時，隨原料粒度的減小，甘草細胞與復合酶接觸面積增大，破壁能力加強，甘草酸的溶出量增加，甘草酸提取率呈上升趨勢；當原料粒度>40目時，隨原料粒度的減小，雜質溶出量增加，大量雜質處于酶解體系中影響甘草酸的溶出，甘草酸提取率下降；當原料粒度為40目時，甘草酸提取率達到最大，見圖6。因此，最佳甘草原料粒度為40目。

圖6 原料粒度對甘草酸提取率的影響

Figure 6 Effect of particle size of raw material on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.2.7 料液比對甘草酸提取率的影響 當料液比>1∶25(g/mL)時，隨溶劑量的增加，更多的甘草酸溶于提取液中，甘草酸提取率逐漸升高；當料液比<1∶25 (g/mL)時，由于過多的提取液使復合酶濃度與底物濃度均下降，進而酶與底物的接觸機會減少，甘草酸提取率降低[13]，當料液比為1∶25 (g/mL)時，甘草酸提取率達到最大，見圖7。因此，最佳料液比為1∶25 (g/mL)。

圖7 料液比對甘草酸提取率的影響

Figure 7 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.3 RSM優化復合酶法提取階段的工藝條件

2.3.1 響應面試驗設計因素、水平及編碼 響應面試驗設計因素、水平及編碼見表2。

2.3.2 Box-Benhnken試驗設計及結果 Box-Benhnken試驗設計方案及結果見表3。

2.3.3 回歸模型及方差分析 運用Design-Expert 8.0.6數據統計分析軟件對表3結果進行多元線性回歸，得甘草酸提取率關于加酶量、酶解時間、酶解溫度、原料粒度的二次多項式數學模型：

表2 響應面試驗設計因素、水平及編碼

表3 Box-Benhnken試驗設計方案及結果

Y=67.70+0.30A-0.52B-0.37C+0.19D+0.098AB+0.065AC-0.42AD-0.39BC-0.45BD-0.76CD-4.59A2-2.07B2-1.58C2-1.14D2。

(3)

結果顯示，A及D對甘草酸提取率影響顯著，B及C對甘草酸提取率影響極顯著；交互項AD、BC對甘草酸提取率影響顯著，交互項BD、CD對甘草酸提取率影響極顯著，其他交互項不顯著；各二次項對甘草酸提取率影響均為極顯著。各因素對甘草酸提取率影響由小到大排列順序為：原料粒度<加酶量<酶解溫度<酶解時間。

表4 模型方差分析

2.3.4 響應面分析及優化結果 運用Design-Expert 8.0.6數據統計分析軟件繪制甘草酸提取率與各因素交互項的響應曲面關系圖(見圖8)。

如圖8所示，甘草酸提取率與各因素交互項的響應曲面關系圖均為開口向下的光滑曲面，甘草酸提取率均有最大值，且甘草酸提取率達到最大值時所對應的各因素水平與單因素試驗研究結果基本相符，進一步說明Box-Benhnken試驗設計所選取的因素水平適宜[13]。

同時，運用Design-Expert 8.0.6數據統計分析軟件預測出復合酶法提取甘草酸的最佳工藝條件為：復合酶量176.64 U/g·底物，時間0.94 h，溫度48.62 ℃，原料粒度43目，且在此最佳工藝條件下甘草酸提取率預測值為67.78%。為方便實際操作，將參數修正為：復合酶量176.6 U/g·底物，時間0.94 h，溫度48 ℃，原料粒度40目，進行3次驗證性實驗，得甘草酸平均提取率為67.22%，標準偏差為0.12%，相對標準偏差為0.18%，與預測值的相對誤差為0.83%，實際值與預測值基本相符，表明運用響應面法優化復合酶法提取甘草酸的工藝條件切實可行，但該實際值低于中心試驗點所得甘草酸提取率，因此選擇中心試驗點為復合酶法提取甘草酸的最佳工藝條件，即最佳復合酶量175 U/g·底物，時間1 h，溫度50 ℃，原料粒度40目。

按1.2.4方法及2.3所得最佳工藝條件對甘草酸進行連續提取，結果顯示，連續提取2次后甘草酸提取率為(68.81±0.21)%，連續提取3次后甘草酸提取率僅為(69.10±0.18)%，表明增加復合酶法提取甘草酸的次數已無法大幅提高甘草酸提取率，所以需要輔以其他方法來進一步使甘草酸從細胞中溶出，進而提高甘草酸提取率，避免甘草資源浪費。

圖8 各因素交互作用對甘草酸提取率的影響

2.4 超聲輔助提取階段的單因素試驗

2.4.1 乙醇濃度對甘草酸提取率的影響 當乙醇濃度<20%時，甘草酸提取率急劇增大，說明在超聲和提取溶劑乙醇的存在下，更多甘草酸由細胞溶出；當乙醇濃度>20%時，乙醇濃度對甘草酸提取率影響不大，甘草酸提取率增加極緩慢，見圖9。為節約成本，選擇乙醇濃度20%為最佳。

2.4.2 料液比對甘草酸提取率的影響 當料液比>1∶35 (g/mL)時，隨溶劑量的增加，甘草酸與提取溶劑的濃度差增大，甘草酸更易溶出，甘草酸提取率呈上升趨勢；當料液比<1∶35 (g/mL)時，由于溶劑量太大，使單位體積提取液所受超聲的機械、空化等作用降低[14]，甘草酸提取率下降。當料液比為1∶35 (g/mL)時，甘草酸提取率達到最大，見圖10。因此，最佳提取料液比為1∶35 (g/mL)。

2.4.3 超聲功率對甘草酸提取率的影響 當超聲功率為200～400 W時，隨超聲功率的增大，超聲產生的機械和空化等作用增強，進而甘草酸的溶出量增大，甘草酸提取率增加[14]。當超聲功率>350 W時，超聲功率對甘草酸溶出量的影響減小，甘草酸提取率隨超聲功率的增加而緩慢平穩增加，見圖11。為節約能源，減小噪音，選擇超聲功率350 W為最佳。

Figure 9 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of glycyrrhizic acid

圖10 料液比對甘草酸提取率的影響

Figure 10 Effect of ratio of material to liquid on the extraction rate of glycyrrhizic acid

圖11 超聲功率對甘草酸提取率的影響

2.4.4 超聲時間對甘草酸提取率的影響 當超聲時間<15 min 時，隨超聲時間的延長，甘草酸的溶出量增加，甘草酸提取率逐漸上升；當超聲時間>15 min時，超聲時間對甘草酸的溶出量影響不大，甘草酸提取率幾乎不增加，見圖12。為節約能源與時間，選擇超聲時間15 min為最佳。

2.4.5 超聲溫度對甘草酸提取率的影響 如圖13所示，當溫度<40 ℃時，隨溫度的上升，甘草酸在提取溶劑中的擴散速率增加，甘草酸更易從原料中溶出，甘草酸提取率升高[15]；當溫度>40 ℃時，隨溫度的升高，提取體系中液體表面張力降低，且由超聲產生的空化泡內的壓力增大，進而超聲波的阻尼增大，甘草酸提取率下降[16]；當溫度為40 ℃時，甘草酸提取率達到最大。因此，最佳超聲溫度為40 ℃。

圖12 超聲時間對甘草酸提取率的影響

圖13 超聲溫度對甘草酸提取率的影響

在上述最佳條件下，按照1.2.8方法，進行復合酶和超聲輔助兩步法提取甘草酸，試驗為3個平行試驗，得甘草酸平均提取率為90.44%，標準偏差為0.14%，相對標準偏差為0.09%，說明本研究復合酶和超聲輔助兩步法提取甘草酸的工藝條件真實可靠，穩定性較好，在實際生產中具有參考價值。謝果等[17]以乙醇為提取溶劑，研究了超聲波法提取甘草酸的工藝，結果顯示，超聲波法提取甘草酸的總操作時間長達2.5 h，且甘草酸提取率僅為87.4%。

3 結論

通過對復合酶和超聲輔助兩步法提取甘草中甘草酸的工藝進行研究，最終得到復合酶和超聲輔助兩步法提取甘草酸的最佳工藝條件，且在最佳工藝條件下甘草酸的提取率可達(90.44±0.14)%。因此，復合酶和超聲輔助兩步法適用于甘草酸的提取，與傳統提取法、超聲波提取法及復合酶法、氨性乙醇浸提法兩步提取相比，具有提取率高、總操作時間短(1.25 h)、條件溫和、高效等優點。

甘草中含有許多活性成分，在采用復合酶和超聲輔助兩步法提高甘草酸提取率的同時，是否會導致其他雜質增多，進而增加甘草酸純化難度，本試驗未作驗證，今后將加以深入研究。