鮮活細(xì)點(diǎn)圓趾蟹中組胺菌的分離鑒定與生長(zhǎng)特性

余 輝陳 潔何志勇張 爽曾茂茂

YU Hui1,2 CHEN Jie1 HE Zhi-yong1 ZHANG Shuang1 ZENG Mao-mao1

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022)

(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China; 2. School of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan, Zhejiang 316022, China)

組胺是一種低分子量的堿性雜環(huán)伯胺，可天然存在于一些海產(chǎn)魚類中，是導(dǎo)致食物中毒的致病物。國(guó)內(nèi)外由魚類中的組胺導(dǎo)致的中毒事件時(shí)有發(fā)生，如鯖科魚類的金槍魚、鯖魚、鰹魚和秋刀魚中毒事件以及非鯖科魚類的鯕鰍、青魚、鯡魚和沙丁魚中毒事件[1-2]。另外，發(fā)酵肉制品、豆豉、酒等發(fā)酵食品組胺中毒也偶有發(fā)生[3-4]。組胺中毒癥狀嚴(yán)重程度與攝入組胺的量有關(guān)，當(dāng)攝入8～40，40～100，100 mg/kg以上組胺時(shí)，可分別出現(xiàn)輕度、中度和重度中毒癥狀[5]。因此，組胺作為海產(chǎn)魚類的重要質(zhì)量指標(biāo)已被廣泛認(rèn)同[6-7]。

食品中的組胺主要是由組胺菌(主要為細(xì)菌)分泌的胞外組胺酸脫羧酶催化魚體中的游離組氨酸發(fā)生脫羧反應(yīng)所產(chǎn)生。目前已從魚及其制品中篩選出大量的組胺菌，主要為腸桿菌科細(xì)菌，其中Enterobacteriaaerogenes、Kelbsiellapneumoniae、Morganellamorganii和Hafniaalvei經(jīng)常出現(xiàn)于組胺中毒的海產(chǎn)魚中[1-2]。另外，從腌制蝦和貝類[8-9]、奶酪[10]、豆豉[11]、香腸[12]以及酒[13]中也篩選出許多組胺菌。研究[14]顯示，凍藏/冷藏可有效控制食品的組胺超標(biāo)，但由于組胺酸脫羧酶具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，一旦解凍其活性可快速恢復(fù)而催化產(chǎn)生組胺。因此，避免組胺菌的污染以及控制其產(chǎn)胺是防止食品中組胺生成與超標(biāo)的主要途徑。

細(xì)點(diǎn)園趾蟹(Ovalipespunctatus)俗稱沙蟹、牛腳蹄，分布于中國(guó)的黃海、東海和南海，盛產(chǎn)于東海與黃海。隨著漁業(yè)資源的衰退，低值細(xì)點(diǎn)圓趾蟹成為了主要漁獲物，年捕撈量高達(dá)2.0×105t以上。細(xì)點(diǎn)圓趾蟹被加工成蟹肉罐頭、冷凍蟹肉糜等，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷日本、韓國(guó)、東南亞、美國(guó)和歐盟。目前，關(guān)于蟹類中組胺的研究相對(duì)較少，僅有遠(yuǎn)海梭子蟹(Portunuspelagicus)和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)低溫保藏中產(chǎn)生組胺的報(bào)道[15-16]。迄今為止，盡管很少有蟹及其產(chǎn)品的組胺中毒事件的報(bào)道，但關(guān)于蟹類過(guò)敏的報(bào)道卻有很多，而輕度組胺中毒與IgE介導(dǎo)的過(guò)敏癥狀很相似，因此可能被誤診為蟹類過(guò)敏[17]。由于細(xì)點(diǎn)園趾蟹捕撈后不易存活，且具有高蛋白以及高游離組氨酸含量等特性[18]，使得其更易受到微生物污染，一旦被組胺菌污染，現(xiàn)有生產(chǎn)加工與儲(chǔ)運(yùn)條件下極有可能會(huì)導(dǎo)致組胺超標(biāo)。然而，有關(guān)蟹類中組胺菌的研究迄今未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬從活細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的腮條和腸中分離鑒定出組胺菌，并進(jìn)一步探討培養(yǎng)條件對(duì)其生長(zhǎng)與產(chǎn)組胺能力的影響，同時(shí)考察殼低聚糖對(duì)細(xì)點(diǎn)圓趾蟹中組胺菌的抑菌效果，以期為細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的生產(chǎn)加工與貯藏提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

活細(xì)點(diǎn)圓趾蟹：購(gòu)于沈家門水產(chǎn)碼頭，裝于有碎冰的泡沫箱中，2 h內(nèi)完成試驗(yàn)；

組胺標(biāo)準(zhǔn)品(≥99.5%)、丹磺酰氯(≥98%)、乙腈：HPLC純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

殼低聚糖(Chitosan oligosaccharides，COS)：GPC測(cè)其分子量<10 kDa，實(shí)驗(yàn)室自制；

其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)：杭州微生物試劑有限公司；

TSBH培養(yǎng)基：3%胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、1%L-組氨酸磷酸鹽和 0.005%磷酸吡哆醛，用于組胺菌的富集和疑似組胺菌的確認(rèn)與產(chǎn)組胺能力分析；

HBI(Histamine-forming bacteria isolation agar)培養(yǎng)基：5 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、2 gL-組氨酸磷酸鹽、1 g碳酸鈣、5 g氯化鈉、0.06 g溴甲酚紫、20 g瓊脂，溶于1 L去離子水，調(diào)pH至5.2～5.3，用于組胺菌的初篩與純化。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱：SPX-250B-Z型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

高效液相色譜儀：Alliance e2695型，美國(guó)Waters公司；

掃描電子顯微鏡：HITACH S-3400N型，日本Hitachi公司；

PCR熱循環(huán)儀：Applied Biosystems?VeritiTM96-Well型，美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 組胺菌的初步篩選 對(duì)鮮活細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的腮條和腸進(jìn)行無(wú)菌取樣、研磨。15 g樣品裝入盛有100 mL TSBH的三角瓶中。30 ℃富集培養(yǎng)72 h后，用無(wú)菌生理鹽水依次稀釋成10-1，10-2，10-3，取1 mL TSBH培養(yǎng)基或稀釋液，采用稀釋混合平板法制成含菌HBI培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)期間根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取藍(lán)色或紫色菌落或有紫色暈環(huán)的菌落，于HBI培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，直至分離出單菌落，取單菌落于TSA斜面中保存，此為疑似組胺菌。

1.2.2 組胺菌的確認(rèn)與產(chǎn)組胺能力分析 挑取活化的疑似組胺菌，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成5.0 lg CFU/mL菌懸液，吸1 mL菌懸液于9 mL TSBH培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h后，再吸1 mL 上述24 h培養(yǎng)液于9 mL 新鮮TSBH培養(yǎng)基中，30 ℃ 培養(yǎng)48 h后，TSBH培養(yǎng)基于12 000×g離心10 min，對(duì)上清液中的組胺進(jìn)行分析。按照Lieberd等[19]的TLC方法分析上清液中的組胺，確認(rèn)疑似菌株是否為組胺菌；按照Yu等[20]的HPLC方法測(cè)定上清液中的組胺含量，確定組胺菌的產(chǎn)組胺能力。

1.2.3 菌株鑒定

(1) 形態(tài)觀察：組胺菌在TSA平板培養(yǎng)12 h，參照Tholozan等[21]方法對(duì)其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察；培養(yǎng)18 h，挑取菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察其染色情況；培養(yǎng)48 h后，采用低倍鏡對(duì)其菌落形態(tài)進(jìn)行觀察。

(2) 分子鑒定：參照Kim等[22]的方法進(jìn)行鑒定。

1.2.4 培養(yǎng)條件對(duì)組胺菌的生長(zhǎng)與組胺生成量的影響 吸1.2.2中5.0 lg CFU/mL菌懸液1 mL，接種于9 mL 新鮮TSBH培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：溫度30 ℃、NaCl含量0.5%、初始pH 7.0，其中單因素溫度設(shè)定為4，15，25，30，35 ℃、初始pH值設(shè)定為4，5，6，7，8，9，10，NaCl含量設(shè)定為0.5%，1.0%，3.0%，5.0%，10.0%，15.0%，靜置培養(yǎng)48 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，菌落總數(shù)采用平板涂布法制成含菌TSA平板，30 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；組胺含量按1.2.2中HPLC方法測(cè)定。

1.2.5 抑菌試驗(yàn) 取7.0 lg CFU/mL組胺菌懸液1 mL，采用稀釋混合平板法制成含菌TSA平板(培養(yǎng)基pH為6.0和7.0)。用無(wú)菌打孔器在平板上打孔，挑出培養(yǎng)基圓餅以做成圓孔。以無(wú)菌生理鹽水為陰性對(duì)照，0.5 mg/mL頭孢克肟生理鹽水溶液為陽(yáng)性對(duì)照，0.1，0.5，1.0 g/100 mL殼低聚糖生理鹽水溶液為抑菌劑。分別向孔中加入80 μL上述5種溶液，做3個(gè)平行平板，30 ℃培養(yǎng)48 h。采用十字交叉法，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。按式(1)計(jì)算殼低聚糖對(duì)組胺菌生長(zhǎng)的抑菌率。

(1)

式中：

c——抑菌率，%；

d1——陽(yáng)性對(duì)照抑菌圈直徑，mm；

d2——?dú)さ途厶且志χ睆剑琺m。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示，采用SPSS 19.0軟件對(duì)其進(jìn)行獨(dú)立樣本T-test檢驗(yàn)，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 組胺菌的篩選

根據(jù)組胺呈堿性的原理利用HBI培養(yǎng)基對(duì)組胺菌進(jìn)行初步篩選，但由于一些微生物可利用HBI選擇性培養(yǎng)基中的酵母提取物和蛋白胨代謝產(chǎn)生其他堿性物質(zhì)[23]，因而本方法所篩選的菌株為疑似組胺菌。從腮條和腸中各獲得3株不同菌落形態(tài)的疑似組胺菌株(表1)，其在HBI培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍(lán)色菌落或藍(lán)紫色暈環(huán)(圖1)。疑似組胺菌均為富集培養(yǎng)基直接涂布于HBI培養(yǎng)基所出現(xiàn)的菌株，而稀釋液在HBI培養(yǎng)基卻未出現(xiàn)疑似組胺菌，表明鮮活細(xì)點(diǎn)圓趾蟹中疑似組胺菌較少。另外，疑似組胺菌均為培養(yǎng)12～24 h就產(chǎn)生藍(lán)紫色暈環(huán)，在培養(yǎng)36 h后整個(gè)平板變成紫色[圖1(c)]，而Niven等[24]報(bào)道35 ℃培養(yǎng)36～72 h才有藍(lán)紫色暈環(huán)出現(xiàn)，但并未對(duì)組胺進(jìn)行定量；Rodriguez-Jerez等[25]報(bào)道芽孢桿菌屬組胺菌(Bacillusspp.)在37 ℃培養(yǎng)48 h才能被檢測(cè)出，其組胺生成量為10.54 mg/L。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)的差異可能是篩選出的疑似組胺菌的產(chǎn)組胺或其他堿性物質(zhì)的能力較高，產(chǎn)生的組胺或堿性物質(zhì)較多。

表1 6株疑似組胺菌的菌落與細(xì)胞形態(tài)

圖1 部分初篩與純化HBI平板

對(duì)獲得的6株疑似組胺菌TSBH培養(yǎng)基中的組胺進(jìn)行TLC分析，結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出，僅OP-G2菌株培養(yǎng)基與標(biāo)樣有紅色遷移斑點(diǎn)出現(xiàn)，而其他菌株培養(yǎng)基均無(wú)紅色遷移斑點(diǎn)出現(xiàn)，而且OP-G2菌株的Rf值為0.795，組胺標(biāo)樣的Rf值為0.796，因此OP-G2菌株可被確認(rèn)為組胺菌。

1. OP-G1 2. OP-G2 3. OP-G3 C. 空白對(duì)照 S. 組胺標(biāo)樣4. OP-I1 5. OP-I2 6. OP-I3

2.2 OP-G2菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 OP-G2菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落為乳黃色圓形、邊緣整齊，外部菌落透明、表面濕潤(rùn)有光澤，直徑為1.1 mm左右[圖3(a)]，菌體黏稠不易挑起，后期菌落邊緣不整齊，表面有皺褶。OP-G2菌株革蘭氏染色呈陰性，單個(gè)細(xì)胞呈桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)或成堆排列[圖3(b)]，掃描電鏡顯示單個(gè)菌體呈短桿狀，大小為0.8～1.0 μm×1.2～1.8 μm，見圖3(c)，其特征與腸桿菌屬的形態(tài)特征基本相似。

2.2.2 OP-G2菌株分子鑒定 OP-G2菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4，得到序列總長(zhǎng)1 393 bp。將上述序列在EzBioCloud網(wǎng)站上(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)進(jìn)行序列相似性比對(duì)，選擇相似度最高的10株菌株的16S rDNA序列，利用Mega 6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖5)，OP-G2菌株與EnterobacteraerogenesKCTC 2190(T)菌株在同一分支上，且16S rDNA序列相似性達(dá)到95%。因此，該菌株被定名為EnterobacteraerogenesOP-G2(簡(jiǎn)稱E.aerogenesOP-G2)。

圖4 OP-G2菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖5 基于16S rDNA序列同源性的OP-G2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 產(chǎn)組胺能力分析

為確定E.aerogenesOP-G2菌株產(chǎn)組胺能力，利用HPLC對(duì)其TSBH培養(yǎng)基中組胺含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，該菌株培養(yǎng)基的HPLC色譜圖在18.095 min出峰，與組胺標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間相吻合，進(jìn)一步表明E.aerogenesOP-G2菌株為組胺菌，定量結(jié)果表明組胺含量為(46.96±1.94) mg/L。腸桿菌科組胺菌可分為兩類[26]，一類在15 ℃以上培養(yǎng)24 h，可產(chǎn)生1 000 mg/L以上組胺的細(xì)菌為高產(chǎn)組胺菌；一類在30 ℃及以上培養(yǎng)48 h，可產(chǎn)生250 mg/L 以下組胺含量的細(xì)菌為低產(chǎn)組胺菌。因此，本試驗(yàn)所篩選的菌株為低產(chǎn)組胺菌。目前，從組胺中毒的食品中分離出的產(chǎn)氣腸桿菌屬組胺菌，既有高產(chǎn)E.aerogenes組胺菌[27]，也有低產(chǎn)E.aerogenes組胺菌[28-29]。因此，需要進(jìn)一步對(duì)E.aerogenesOP-G2菌株的生長(zhǎng)與產(chǎn)組胺特性進(jìn)行研究。

圖6 E. aerogenes OP-G2菌株TSBH培養(yǎng)基中組胺的HPLC色譜圖

Figure 6 HPLC chromatogram of histamine in TSBH medium inoculated withE.aerogenesOP-G2 strain

2.4 培養(yǎng)條件的影響

考察了不同培養(yǎng)溫度、初始pH值和NaCl含量對(duì)E.aerogenesOP-G2菌株的生物量與組胺生成量的影響，結(jié)果見圖7。由圖7(a)可知，該菌株30 ℃時(shí)菌落總數(shù)和組胺生成量均達(dá)到最高，分別為(9.55±0.45) lg CFU/mL和(46.78±2.13) mg/L。在4～30 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，菌落總數(shù)和組胺生成量均增大，與Rodtong等[30]的結(jié)果相一致。盡管4 ℃下該菌株生長(zhǎng)繁殖被抑制[(3.95±0.48) lg CFU/mL]，但其培養(yǎng)基中仍有少量組胺生成(3.46 mg/L)，可能是E.aerogenes組氨酸脫羧酶在4 ℃下仍能保持活性[31]，即細(xì)菌代謝所分泌的少量胞外組氨酸脫羧酶仍能催化游離組氨酸轉(zhuǎn)化為組胺。另外，相比于30 ℃，4 ℃對(duì)菌株組胺生成量的抑制率高達(dá)92.60%。

由圖7(b)可看出，初始pH 7.0時(shí)菌落總數(shù)最大，即(9.55±0.58) lg CFU/mL。當(dāng)初始pH≤5.0或≥9.0時(shí)菌落總數(shù)均顯著降低(P<0.05)。與菌落總數(shù)不同，菌株的組胺生成量卻在初始pH 6.0時(shí)最大，即(53.28±1.79) mg/L。當(dāng)初始pH≤5.0或≥8.0時(shí)其組胺生成量均顯著降低(P<0.05)，而pH 9.0和10.0比pH 4.0更能顯著降低菌株的組胺生成量(P<0.05)，且相比于pH 6.0，pH 10.0對(duì)該菌株的組胺生成量的抑制率達(dá)到79.81%。可能是在微酸性條件下，組胺菌快速分泌組氨酸脫羧酶催化游離組氨酸脫羧生成組胺，促使培養(yǎng)基中pH值達(dá)到適宜生長(zhǎng)條件[32]；也可能是該菌株組氨酸脫羧酶最適pH值為弱酸性，如Rodtong等[30]報(bào)道的E.aerogenes組胺菌在pH 5.0時(shí)組胺生產(chǎn)量最高，而Zou等[31]報(bào)道E.aerogenesDL-1組胺菌組氨酸脫羧酶的最適pH為6.5，亦為弱酸性。

圖7(c)顯示，0.5%～3.0% NaCl對(duì)菌株的菌落總數(shù)和組胺生成量均無(wú)顯著影響(P>0.05)，且NaCl含量1.0%時(shí)，菌落總數(shù)和組胺生成量均最高，分別為(10.33±0.54) lg CFU/mL 和(50.68±1.63) mg/L，與Wendakoon等[32]報(bào)道的一致，表明低鹽促進(jìn)組胺菌的生長(zhǎng)與產(chǎn)組胺能力[33]。當(dāng)NaCl含量提高到5.0%時(shí)，菌株的菌落總數(shù)和組胺生成量均顯著降低(P<0.05)，NaCl含量≥10%時(shí)，菌株生長(zhǎng)繁殖和組胺生成能力幾乎被抑制；相比于NaCl含量1.0%，NaCl含量≥10%時(shí)對(duì)菌株組胺生成量的抑制率高達(dá)98.95%以上。綜上所述，低溫(<4℃)和/或高NaCl含量(≥10%)能有效控制E.aerogenesOP-G2的生長(zhǎng)和組胺生成量。

不同小寫字母表示差異性顯著(P<0.05)

圖7 溫度、初始pH值和NaCl含量對(duì)E.aerogenesOP-G2菌株生長(zhǎng)與組胺生成量的影響

Figure 7 Effect of the temperature, initial pH and NaCl content on growth and histamine production of strainE.aerogenesOP-G2

2.5 抑菌試驗(yàn)

以頭孢克肟為對(duì)照，考察了不同濃度的殼低聚糖對(duì)E.aerogenesOP-G2組胺菌的抑菌效果，結(jié)果見圖8。結(jié)果表明，隨著COS濃度的增大，對(duì)E.aerogenesOP-G2菌株的抑菌效果顯著增強(qiáng)(P<0.05)。當(dāng)COS濃度≥0.5 g/100 mL時(shí)，對(duì)E.aerogenesOP-G2菌株抑制率均在30.58%以上，表明COS對(duì)該菌株有較好的抑制效果；pH值對(duì)COS的抑菌活性的影響具有顯著性差異(P<0.05)，且當(dāng)pH 6.0時(shí)，1.0 g/100 mL 濃度COS對(duì)E.aerogenesOP-G2菌株抑菌率高達(dá)47.57%，可能是酸性條件下COS游離氨基帶正電荷，更有利于與帶負(fù)電荷的菌體結(jié)合，干擾菌體代謝通路，從而起到抑菌效果[34]。

不同小寫字母表示同一pH不同COS濃度之間的差異性顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同一濃度不同pH之間的差異性顯著(P<0.05)

圖8 殼低聚糖對(duì)E.aerogenesOP-G2菌株的抑菌率

Figure 8 Bacteriostasis rates of chitosan oligosaccharides to strainE.aerogenesOP-G2

3 結(jié)論

本研究從鮮活細(xì)點(diǎn)園趾蟹的腮條中分離鑒定出1株組胺菌，經(jīng)鑒定命名為EnterobacteraerogenesOP-G2，其組胺生成量為(46.96±1.94) mg/L(30 ℃培養(yǎng)48 h)。低溫(<4 ℃)和/或高NaCl含量(≥10%)都能有效控制E.aerogenesOP-G2菌株的生長(zhǎng)和組胺生成量，且對(duì)菌株的組胺生成量的抑制率高達(dá)92%以上。當(dāng)COS濃度≥0.5 g/100 mL時(shí)，對(duì)E.aerogenesOP-G2菌株抑制率均在30.58%以上，且當(dāng)pH 6.0時(shí)，1.0 g/100 mL濃度的COS對(duì)E.aerogenesOP-G2菌株的抑制率高達(dá)47.57%。本研究結(jié)果可為細(xì)點(diǎn)圓趾蟹的加工與保藏提供參考。

本試驗(yàn)采用HBI培養(yǎng)基從細(xì)點(diǎn)圓趾蟹中篩選獲得1株腸桿菌屬組胺菌，后續(xù)試驗(yàn)可采用TCBS和PI-CFC培養(yǎng)基聯(lián)合HBI培養(yǎng)基對(duì)細(xì)點(diǎn)圓趾蟹中弧菌屬和假單胞菌屬中組胺菌進(jìn)行篩選。另外，僅研究了組胺菌在TSBH培養(yǎng)基中的產(chǎn)組胺特性，后續(xù)試驗(yàn)可對(duì)組胺菌在細(xì)點(diǎn)圓趾蟹或蟹肉中的產(chǎn)組胺特性進(jìn)行研究。