海南石解與昌江石解體外抗菌活性實驗研究

楊柳 滕李濛 黃內力 景浩瑞 黃秋芳 鮑勇財 王美軒 余邦良 楊文

摘要 為探索海南石解（Dendrobium hainanense）和昌江石解（Dendrobium changjiangense）不同提取部位的體外抗菌效果，以金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、白色念珠菌為受試菌株，采用倍比稀釋法、瓊脂平板法對海南石解和昌江石解不同部位進行抗菌活性篩選，并考察對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的生長抑制曲線和電導率變化情況。結果表明，A、E能顯著抑制金黃色葡萄球菌的正常生長，A對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）為2.5mg/mL，最低殺菌濃度（MBC）為5.0mg/mL;E對金黃色葡萄球菌MIC和MBC均為2.5mg/mL;且E極顯著增加金黃色葡萄球菌的滲透性。A、C、E顯著抑制白色念珠菌的正常生長，F極顯著抑制白色念珠菌的正常生長，增加白色念珠菌的滲透性，F對白色念珠菌的MIC和MBC均為1.25mg/mL。表明海南石解的乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌有較強抗菌效果，昌江石解的乙酸乙酯部位對白色念珠菌具有較強抗菌效果，該結論為海南石解和昌江石解進一步開發奠定了科學基礎。

關鍵詞 海南石解;昌江石解;提取物;抗菌活性

中圖分類號 S567.239 文獻標識碼 A

石解作為中國傳統藥材，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳等功效。現代醫學研究表明：石斛化學成分較為復雜，主含有糖類、生物堿、菲類、香豆素、氨基酸等，具抗氧化、抗炎、降血糖、調血脂、抗菌等功效[1-4]，不同產地、品種、栽培時間的石解，其化學成分不同，藥效也不盡相同[5-6]。何勁等[7]從貴州產的金釵石解和流蘇石解中分離到4株具有強烈拮抗真菌的內生細菌，結果表明，該菌對19株絲狀真菌有抑制作用。張周英等[8]從廣東產的鐵皮石解和金釵石解中提取多糖，結果發現，從這兩種石解中提取的多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎球菌均有明顯的抑菌作用。

海南石解（Dendrobium hainanense）和昌江石解（Dendrobium changjiangense）主要分布于海南三亞、陵水、瓊中、昌江、白沙、定安等地區[9]，為海南特有石解屬物種[10]。有文獻報道，石解屬植物具有一定抗菌活性[1l-12]。目前，有關海南石解和昌江石解的研究報道較少。如張友源[13]等對海南石解化學成分進行研究，尚未發現海南石解和昌江石解抗菌藥理活性報道。因此，為進一步開發利用海南這2種天然石解資源，本文采用4種菌株，通過監測抑制菌體生長曲線，探究菌體電導率的變化和菌體細胞膜的滲透性影響，初步探討抗菌機制，以期為海南石解和昌江石解作為天然植物類抗菌藥物開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

2016年9月采自海南省昌江縣霸王嶺，經鑒定，為蘭科石解屬海南石解（D.hainanense）和昌江石解（D.changjiangense），現存放于海南醫學院化學實驗教學中心，編號分別為HNSH-201609、CJSH-201609。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌（S.aureas ATCC 25923）、白色念珠菌（C.albicans ATCC 10231）、大腸桿菌（E.coliATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（K pneumoniae ATCC13883）均購自廣東省菌種保藏中心。

1.1.3 試劑

沙保羅氏瓊脂、沙保羅液體增菌培養基（杭州濱和微生物試劑有限公司）; MH肉湯培養基（青島高科園海博生物技術有限公司）;MH瓊脂培養基（廣東環凱生物科技有限公司）;DMSO（阿拉丁試劑有限公司）;酯酸氯己定（成都第一制藥原料藥有限公司）;萬古霉素（浙江海正藥業股份有限公司）;吐溫80、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（均為分析純，購于西隴化工股份有限公司）。

1.1.4 儀器

RE-52CS-2型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）;DZF-6050型真空減壓干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）;SPX-150B-2Z型生化培養箱（上海博遠實業有限公司醫療設備廠）;LDZX-40BI型高壓消毒鍋（上海申安醫療器械廠）;THZ-1038型恒溫培養搖床（上海一恒科學儀器有限公司）;UV1800PC型紫外可見分光（海鳳凰光學科儀有限公司）;SP-DJ系列凈化工作臺（上海浦東物理光學儀器廠）;DDS-12A型電導率儀（上海虹益儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同提取物的制備

參照張友源等[13]方法，制得海南石斛乙醇部位（A） 163.5g、昌江石解乙醇部位（B）147.8g、海南石解石油醚部位（C）24.4g、昌江石解石油醚部位（D）20.8g、海南石斛乙酸乙酯部位（E）22.6g、昌江石解乙酸乙酯部位（F）12.4g、海南石斛正丁醇部位（G）17.3g、昌江石斛正丁醇部位（H）16.9g。

1.2.2 實驗分組及樣品溶液的制備

稱取A、B、C、D、E、F、G、H各400mg、分別加入10mL、10%DMSO水溶液，滴入10滴吐溫80，超聲溶解至溶液澄清，配制成待測樣品溶液，以不加樣品作為對照。稱取400mg的萬古霉素（酯酸氯己定），用相同溶劑溶解，作為檢測細菌（真菌）的陽性藥物。其他分組如表1、表2所示。

1.2.3 實驗菌液的配制

參照中國藥典方法[14]，分別配制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌菌液，稀釋至濃度均為1×10⁶CFU/mL。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）測定

采用倍比稀釋法[15]，取1～7號試管，分別加入體積相同已配好的MH肉湯液體培養基（細菌培養）或沙氏液體培養基（真菌培養），將待測樣品溶液或陽性藥物從1號管依次倍比稀釋至7號管，使待測樣品濃度分別為20.000、10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.312mg/mL。8號試管加入3mL 10%DMSO水溶液（3滴吐溫80）;9號試管加入3mL培養基溶液;用移液器吸取100μL細菌（1×10⁶CFU/mL）依次加入1～9號試管內，10號試管不加受試菌，加入3mL不同部位提取物和3mL培養基溶液;11號試管不加受試菌，加入3mL不同部位提取物溶液。搖勻，置于37℃恒溫箱內，細菌考察培養24h后觀察結果，真菌考察培養48h后觀察結果。在對照管符合要求的情況下[15]，凡無肉眼可見細菌生長的不同部位提取物最低濃度即為待測藥物對該測試菌的MIC。

1.2.5 最低殺菌濃度（MBC）測定

分別從觀察MIC試管中移取O.1mL溶液于相應培養基瓊脂平板上作次代培養，置于37℃恒溫箱內，細菌考察培養24h后觀察結果，真菌考察培養48h后觀察結果，觀察有無菌落生長。以無菌落生長的藥物濃度作為該受試菌的MBC[15]。

1.2.6 細菌生長抑制曲線的影響

取有抑菌、殺菌效果的不同部位與相應作用的菌株，考察該菌在藥物作用下對菌體生長抑制情況。根據1.2.5結果進行分組：待測藥物組、不加菌的培養基為參比組，不加藥物只加菌和培養基為陽性對照組（菌液濃度為1×10⁶CFU·mL^-1）。以1倍MIC和2倍MIC藥物濃度值為考察點，以上各實驗組均加入相應的培養基（肉湯培養基或沙氏培養基），置于37℃、120r/min培養，每隔2h取樣，細菌培養24h，真菌培養48h于波長600nm處測定吸光度。以取樣時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制曲線[16-17]。

1.2.7 對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌細胞膜滲透性的影響

根據1.2.5、1.2.6實驗結果，參照前人方法[18]，分別將濃度為1MIC、2MIC的藥物、40mg/mL萬古霉素（酯酸氯已定）加入帶菌懸液的培養基中，陽性對照組為菌體培養基，置于37℃恒溫培養，分別于0、2、4、6、8、10、12h取樣，測量電導率，實驗重復3次，取平均值。以取樣時間為橫坐標，電導率為縱坐標繪制曲線，觀察各個部位對菌體細胞膜滲透的影響。

1.3 數據統計分析

采用單因素t檢驗方法，SPSS19.0軟件對所有數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 藥物最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）測定

由于受試藥物為有色非透明物質，需要平板劃線觀察MIC。以小于5個菌落，且菌落數明顯少于陽性對照組所對應試管最大稀釋度的藥物濃度為MIC[19-20]。由表1～3可知，對于金黃色葡萄球菌：A，E抑菌和殺菌效果比較好，A的MIQV2.5mg/mL、MBC為5mg/mL，E的MIC和MBC均為2.5mg/mL;F、G的抑菌和殺菌效果較差，F的MIC為10mg/mL、MBC為20mg/mL，G的MIC、MBC均為20mg/mL;A、E、F、G的抑菌、殺菌效果呈現量效關系，其他部位對金黃色葡萄球菌沒有明顯的抑菌、殺菌效果。對于白色念珠菌：C、E、F均有較強的抑菌、殺菌效果，其MIC分別為2.5、5、1.25mg/mL，MBC分別為2.5、5、1.25mg/mL;其中F在1.25～5mg/mL具有較強的的抑菌、殺菌效果，但濃度達10、20mg/mL后抑菌、殺菌效果較差，這種在一定濃度范圍具有殺菌的作用與75%乙醇性質相似，并沒有明顯呈現藥物作用的量效關系;A、C、E與陽性對照相比，差異顯著;F與陽性對照相比，差異極顯著。2種石解的8個不同部位對大腸桿菌和肺炎克雷伯菌均沒有任何抗菌的效果。

2.2 細菌生長抑制曲線的影響

選擇A、E、F、G考察對金黃色葡萄球菌生長抑制情況，選擇A、B、C、E、F考察對白色念珠菌生長抑制情況。由圖1可知，金黃色葡萄球菌的陽性對照組在8h之前細菌繁殖較慢，為細菌生長的遲緩期，隨后生長繁殖速度加快，進入對數生長期;A、E、F、G高濃度和低濃度溶液處理后的金黃色葡萄球菌生長均受到一定的抑制，且隨著藥物濃度的增加，對細菌生長的抑制作用增強，說明具有一定量效關系。其中A、E與陽性對照間差異顯著，能有效抑制金黃色葡萄球菌的生長。

由圖2、3可知，白色念珠菌陽性對照組16h之前生長繁殖較慢，隨后速度增加，進入對數生長期，30 h后進入穩定期，其吸光值為1.998。A、B、C、E、F高濃度和低濃度處理后的白色念珠菌生長均受到一定的抑制，吸光值增長速度較慢，在菌體對數生長期吸光值增長速度顯著小于陽性對照，說明菌體繁殖速度遠遠低于陽性對照組。A、C、E與陽性對照間差異顯著;F與陽性對照間差異極顯著。藥物濃度越高，抑制菌體生長越明顯。藥物作用后的菌體在整個生長期內，吸光度先上升后下降，這也許是由于藥物使細菌自身發生了應激反應，使菌體在一定時間內決速生長，隨后菌體生長被抑制，出現曲線下降趨勢，說明A、C、E、F對菌體生長具有較好的抑制作用，這與周本宏[21]結論相似。

由此可見，A、E對金黃色葡萄球菌具有較好抑菌效果，F對金黃色葡萄球菌具有一定抑菌效果，C、E、F對白色念珠菌具有較好抑菌效果。

2.3 對菌體細胞膜滲透性的影響

選擇A、E、F考察金黃色葡萄球菌對電導率的影響，選擇C、E、F考察白色念珠菌對電導率的影響。由圖4可知，對于金黃色葡萄球菌：與陽性對照相比，E的兩個濃度電導率增加較快，差異極顯著;與萬古霉素比較，E的兩個濃度電導率差異不顯著，說明其對菌體細胞膜的滲透性相似（P>0.05）。對于白色念珠菌：與陽性對照相比，F和高濃度E電導率增加較快，差異不顯著;與酯酸氯己定比較，F的低濃度電導率差異不顯著，說明其對菌體細胞膜的滲透性相似（P>0.05）。

3 討論與結論

張在強等[2]發現，迭鞘石解醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌和殺菌作用較好;王琳等[11]發現，齒瓣石解提取物對金黃色葡萄球菌抗菌效果較好。本研究通過4種菌株對海南石解和昌江石解不同提取部位抗菌活性進行篩選，采用倍比稀釋法和瓊脂平板法對8個不同部位進行抗菌實驗，測定各個部位的MIC和MBC值。結果表明，對金黃色葡萄球菌：A、E抑菌、殺菌效果比較好，F、G抑菌作用較弱，B、C、D沒有抑菌、殺菌作用;對白色念珠菌：A、C、E、F均有較強的抑菌、殺菌效果，B有一定抑菌、殺菌效果，D、G、H沒有抑菌、殺菌效果。該方法是目前體外抗菌活性篩選的常用方法，可行性較高。其研究結果與前人結論相似，海南石解和昌江石解對金黃色葡萄球菌抗菌的MIC值均比前人報道的石解屬其他石解的MIC值低[2，11-12]，但這2種石解的不同提取部位對白色念珠菌的抗菌效果較好，這值得進一步研究。

采用具有抗菌活性部位的MIC、2MIC兩個不同濃度，考察對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌菌體正常生長抑制性及對菌體細胞膜滲透性。結果表明，E能有效抑制金黃色葡萄球菌正常生長，提高菌體細胞膜的滲透性，與萬古霉素抗細菌實驗結果相似，具有很好抗菌效果，該結論與尹永潔[22]研究結果相似;E對金黃色葡萄球菌抗菌效果較好，這與張薇薇等[12]疊鞘石解水提取部位對金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性的研究結果不同。F能有效抑制白色念珠菌正常生長，且能夠提高菌體細胞膜的滲透性，與酯酸氯已定抗細菌實驗結果相似（P>0.05），具有較好抗真菌效果，這與吳晶[23]結論相似。

綜上所述，海南石解的乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌有較強抗菌效果，昌江石解的乙酸乙酯部位對白色念珠菌具有較強抗菌效果。本研究初步探究了石解體外抗菌的機制，為以后開發抗菌藥物奠定前期基礎。

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