舟山海島地區新重組GII.P16-GII.2型諾如病毒基因特征分析

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諾如病毒是引起人類非細菌急性胃腸炎的首要病原體[1]。全世界范圍內約1/5的腹瀉病例與諾如病毒感染相關，每年約導致20萬人死亡[2]。諾如病毒進化變異速度快，每隔2～3年會出現新的流行株引發大流行，其機制[3]主要是：①諾如病毒衣殼蛋白區氨基酸發生突變，其中P區處于高度變異，被認為是免疫識別和與人體組織血型抗原(HBGA)結合的關鍵部位[4]；②基因重組。在過去二十年間諾如病毒GII.4型一直為優勢流行株[5]，直至2014-2015冬季在多個亞洲地區國家新型GII.P17-GII.17型基因型取代GII.4_Sydney_2012型成為優勢流行株[6]；但中國CDC報道自2016下半年以來新重組基因型GII.P16-GII.2在諾如病毒暴發病例中檢出率超過GII.P17-GII.17及GII.4型，成為我國引起急性胃腸炎暴發的優勢基因型[7]。本文收集舟山海島地區2017年5-11月4起學校發生的急性胃腸炎暴發疫情病例樣本，通過擴增其聚合酶-衣殼區(B-C區)，近乎完整的聚合酶區(RdRp)及衣殼蛋白區(VP1)基因序列，鑒定引起本輪諾如病毒暴發疫情的基因型別及分子特征，為諾如病毒的防控提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1樣本來源及處理 2017年5-11月，舟山市定海區兩所幼兒園、一所小學及普陀區一所小學共發生4起急性胃腸炎暴發事件，疫情所在的縣區疾控共送檢40例樣本，其中肛拭子21份、嘔吐物13份、糞便6份；對固體樣本取豌豆大小 (液體取100 μL) 加到1.5 mL EP管中，加入900 μL的pH 7.2的PBS (10 mmol/L) 緩沖液，振蕩1 min。然后靜置5 min，再以10 000 r / min離心3 min，然后吸取200 μL上清液，使用QIAGEN Reansy Mini Kit試劑盒按照說明書提取病毒核酸。

1.2諾如病毒篩查 使用TAKARA公司One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒用于GI型和GII型諾如病毒篩查。其中GI型反應體系25 μL，包括20 μmol/L的JJV1F/JJV1R/JJV1P各0.5 μL，2×RT-PCR buffer 12.5 μL，5 U/μL EX Taq HS 0.5 μL，RT Ezyme Mix II 0.5 μL，雙蒸餾水5 μL，RNA 5 μL；GII型反應體系25 μL，包括20 μmol/L的JJV2F/JJV2R/JJV2P各0.5 μL，2×RT-PCR buffer 12.5 μL，5 U/μL EX Taq HS 0.5 μL，RT Ezyme Mix II 0.5 μL，雙蒸餾水5 μL，RNA 5 μL，引物探針序列見表1。反應在ABI公司ViiA-7上進行，實驗條件設置如下：42 ℃ 10 min反轉錄，95 ℃ 15 min預變性，45個循環95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，Ct值≤40判定為陽性。

1.3聚合酶區-衣殼區擴增及測序 將諾如病毒陽性的樣本，使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit試劑盒擴增GII型聚合酶區-衣殼區(557 bp)進行分型，反應體系25 μL,包括5xRT-PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP mix 1 μL，RT-PCR Enzyme mix 1 μL，20 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，50 μmol/L MON431/G2SKR各0.5 μL，雙蒸餾水11 μL，RNA 5 μL；實驗條件設置如下：42 ℃ 30 min反轉錄；95 ℃ 15 min預變性；40個循環95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min延伸。取10 μL擴增產物進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。陽性擴增產物送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.4聚合酶區和衣殼蛋白區擴增及測序 經分型后證實本輪暴發疫情均由諾如病毒GII.P16-GII.2所引起，隨機選擇其中1份陽性樣本使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit 試劑盒擴增近乎完整的RdRp區(1 153 bp)及VP1(1 580 bp)，其中擴增RdRp區反應體系25 μL，包括5xRT-PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP mix 1 μL，RT-PCR Enzyme mix 1 μL，20 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，50 μmol/L RdRp-3875F/RdRp-5259R各0.5 μL，雙蒸餾水11 μL，RNA 5 μL；擴增VP1區反應體系25 μL，包括5xRT-PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP mix 1 μL，RT-PCR Enzyme mix 1μL，20 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，50 μmol/L VP1-5025F/VP1-6731R各0.5 μL，雙蒸餾水11 μL，RNA 5 μL。實驗條件設置如下：42 ℃ 30 min反轉錄；95 ℃ 15 min預變性；35個循環95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min；72 ℃ 7 min延伸。取10 μL擴增產物進行1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。陽性擴增產物送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.5基因型別鑒定及序列分析 使用MEGA 6.06 Clustal W將擴增的序列進行比對，并采用Neighbor Joining構建系統進化樹。使用Simplot軟件分析毒株的重組位點，采用200 bp的滑動窗口，20 bp的滑動步伐。使用BioEdit v.7.0.1軟件對序列編輯，同源性分析，并將RdRp區及VP1堿基序列翻譯氨基酸序列與代表株進行序列比對；同時通過諾如病毒在線分型工具(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool)鑒定其型別，并與由系進化分析判定的型別進行比較，本文使用的參考序列均來源于NCBI。

表1 諾如病毒分子檢測所用引物與探針序列Tab.1 Primer and probe sequence used in molecular detection for norovirus

注：*1-6引物/探針用于 real-time PCR，7-12用于常規RT-PCR

2 結 果

2.1流行概況 2017年5-11月舟山市海島地區定海區兩所幼兒園與一所小學、普陀區一所小學分別發生急性胃腸炎暴發疫情，總病例數69例，暴發流行時間最短4 d，最長10 d；疫情呈明顯聚集性多發生于同一宿舍、班級及相鄰班級。病例年齡組在3～10歲，臨床表現以惡心、嘔吐為主伴隨不同程度發熱、腹瀉、腹痛，無重癥病例及死亡病例。結合流行病學調查及實驗室檢測結果判定該起疫情排除水源性和食源性傳播的可能性，認為是由諾如病毒感染引起的人傳人暴發事件。

2.2諾如病毒篩查結果 對送檢的40份樣本進行諾如病毒GI型和GII型熒光定量檢測，其中陽性樣本27例，均為諾如病毒GII型，陽性檢出率67.50%，見表2。

2.3聚合酶區-衣殼區擴增結果及序列分析 聚合酶區-衣殼區擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，27份樣本均在557 bp出現特異性條帶。送至上海生工生物工程公司進行序列測定，均測序成功，經諾如病毒在線分型工具判定均為GII.P16-GII.2型，見表2。系統進化分析結果顯示GII.P16-GII.2型27份，與在線分型工具所得結果一致，各個毒株間序列高度同源，相似性為98.8%～100%，見圖1。

表2 4起暴發疫情諾如病毒分子檢測結果Tab.2 The molecular detection results of norovirus in four acute gastroenteritis outbreaks

2.4聚合酶及衣殼蛋白區擴增結果及序列分析 聚合酶區和衣殼蛋白區擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，均出現特異性條帶。送至上海生工生物工程公司進行序列測定，測序成功后經諾如病毒在線分型工具判定為GII.P16與GII.2型。將所得序列提交至NCBI，獲得序列號：MH057762。Simplot軟件重組分析顯示，重組位點位于ORF1-ORF2連接區處1 120-1 122 bp(AY134748,5 052-5 053 bp)，見圖2。 經系統進化結果可見，2016-2017年新重組型GII.P16型及GII.2型均來源于2010-2012年日本的GII.P16-GII.2毒株，本次舟山海島地區幼兒園中流行暴發的GII.P16型隸屬于GII.P16c簇與2016江蘇的毒株同源性最高，為99.7%，GII.2型隸屬于GII.2c簇與2016年北京的毒株同源性最高，為99.9%，見圖3,4。將本次分離出來的新重組毒株GIIP.16-GII.2與代表株進行RdRp區及VP1區氨基酸序列比對，均發現多個位點發生突變，在RdRp區D173E、S293T、V332I、K357Q及T360A位點的突變僅發生在2016-2017年重組株的GII.P16c簇中；與GII.2代表株VP1區氨基酸序列相比，GII.2 a,b,c 三簇在P區均有多個位點突變，在潛在抗原表位及與人體HBGA結合的位點周圍共12個氨基酸位點發生突變，2016-2017年的GII.2c簇中并不存在特異性突變。見表3，4。

注:諾如病毒命名規則按諾如病毒/基因型/宿主/國家/年份/基因亞型/分離地點/序號[8]圖1 27株諾如病毒聚合酶區-衣殼區序列系統進化分析結果Fig.1 Phylogenetic analysis on partial RdRp and capsid protein sequences of 27 norovirus strains in Zhoushan Islands,2017

圖2 Simplot分析2017年舟山海島GII.P16-GII.2重組位點結果Fig.2 The recombination breakpoint result of GII.P16-GII.2,Zhoushan Islands,2017

圖3 GII.P16型RNA聚合酶區序列系統進化分析結果Fig.3 Phylogenetic analysis results of GII.P16 RdRp sequences

圖4 GII.2型VP1區序列系統進化分析結果Fig.4 Phylogenetic analysis results of GII.2 VP1 sequence

表3 舟山市海島地區GII.P16型諾如病毒RdRp區氨基酸序列變異結果Tab.3 The amino acid sequence mutation of GII.P16 RdRp region in Zhoushan Islands

表4 舟山市海島地區GII.2型諾如病毒衣殼蛋白區氨基酸序列變異結果Tab.4 The amino acid sequence mutation of GII.2 VP1 region in Zhoushan Islands

注：(1)由GII.4型提示可能潛在的諾如病毒A抗原表位位點(294,296-298,368,372)[9]
(2)GII.2與人體HBGA受體結合的3個位點[10]

3 討 論

諾如病毒為杯狀病毒科諾如病毒屬，為單鏈正股RNA病毒，全長約7.5-7.7 kb，整個基因組可分為ORF1、ORF2、ORF3三個開放讀碼框(ORFs),分別編碼包含RNA聚合酶(RdRp)的非結構蛋白，主要衣殼蛋白(VP1)及次要衣殼蛋白(VP2)[11]。基于RdRp區和VP1基因序列的差異可將諾如病毒分為GI-GVII 7個基因群，GI，GII，GIV可感染人類[12]。2017年5-11月舟山市海島地區發生4起由諾如病毒GII.P16-GII.2型引起的急性胃腸炎暴發疫情，且都發生在低年齡人群學校場所。中國CDC一篇文獻報道，2016年我國大陸由諾如病毒引起的急性胃腸炎暴發中新重組的GII.P16-GII.2型檢出率為79%[7]；同期我國香港及臺灣、德國、日本、法國等報道自2016年以來GII.P16-GII.2型諾如病毒引起的暴發疫情顯著增加，且與本區域類似，大多數暴發疫情是發生在幼托，幼兒園，小學等場所[13-17]；吳冰珊等認為GII.P16-GII.2型類似于GII.4型，具有在局部人群的傳播能力[18]；但GII.4型多暴發于養老院等長期的健康護理機構[19]；傳播方式傾向于人與人接觸傳播[20]，GII.P16-GII.2傳播模式是否類似于GII.4型還需進一步驗證；本次舟山海島地區分離出來的毒株GII.P16，GII.2分別與同處沿海地區江蘇省，北京市2016年報道的GII.P16及GII.2型毒株同源性最高，此前有文獻報道，對1999-2011年我國的諾如病毒重組株分析，多數型別均分布在沿海地區，且推斷受諾如病毒污染海產品的廣泛銷售有助于諾如病毒基因型的傳播與分布[21]。

舟山海島地區分離出來的GII.P16-GII.2型毒株，擴增近乎完整的RdRp區及VP1區，通過與代表株序列比對，在RdRp區D173E、S293T、V332I、K357Q及T360A位點的突變僅發生在2016-2017年重組株GII.P16c簇中；與GII.2代表株VP1區氨基酸序列相比，GII.2 a,b,c 三簇在P區均有多個位點突變，但在2016-2017年的GII.2c簇中并不存在特異性位點突變。在GII.4型及GII.P17型的進化過程中，P區氨基酸的變異往往對新流行株的出現，及其抗原性的轉變與易感人群范圍的擴大有關鍵性的作用，使得新流行株能夠逃避人群免疫力而引起廣泛的流行[22-23]，而本次新重組GII.P16-GII.2型VP1區序列分析結果提示P區位點的變異并不是促使本輪新重組株GII.P16-GII.2暴發流行的關鍵因素；采用Simplot軟件對本次分離的毒株的重組位點進行分析，結果顯示重組位點位于ORF1/ORF2連接處1 120-1 122 bp(AY134748,5 052-5 053 bp)，該區域為諾如病毒發生基因重組的主要區域[24]，基因重組是諾如病毒的進化重要機制之一，往往發生于不同亞型的混合感染病例中，衣殼蛋白區結合不同的聚合酶區，能夠改變病毒的復制與傳播能力，或者產生新的諾如病毒亞型，造成抗原性漂變，從而能夠逃避人群免疫力，引發大范圍的暴發流行[25]。值得注意的是近年GII.P16的重組株不斷被發現，表明GII.P16型RdRp區已進化具備結合多種型別衣殼蛋白區的能力，對最近出現的重組株GII.P16-GII.2及GII.P16-GII.4_Sydney2012型RdRp區分析發現有5個氨基酸位點特異性突變，并且此5個位點靠近RdRp功能區[26]，有學者推測GII.P16型RdRp區這些位點的突變改變了新重組型病毒的傳播能力，從而使其能夠廣泛的流行[27]；由于目前對于GII.P16-GII.2認識尚還不全面，這些氨基酸位點突變對于GII.P16-GII.2型的流行的貢獻還待進一步確認。

舟山市海島地區在本輪暴發疫情中首次檢測到了諾如病毒新重組型GII.P16-GII.2，提示在今后的監測工作中開展諾如病毒的RdRp及VP1區序列檢測、監控本區域內諾如病毒重組情況及特殊氨基酸位點的改變，以期及時識別新出現的變異株，同時加強監測力度，明確該重組型別流行特征、趨勢及是否存在特異性臨床特征及易感人群的改變，為本區域諾如病毒的防控提供科學的依據。