制大黃-川芎藥對通過TLR4/Myd88/NF-κB信號對造影劑誘導大鼠腎小管上皮細胞凋亡及腎組織炎癥因子IL-6、IL-1β的影響

郝 健 許麗萍 呂鐵鋼

(內蒙古醫科大學附屬醫院腎內科，內蒙古 呼和浩特 010050)

造影劑腎病(CIN)主要是由于使用含碘造影劑(CM)而引起的急性腎損傷，通常伴隨血清肌酐(Scr)在48～72 h內較基礎值顯著上升25%或增加0.5 mg/dl(44 μmol/L)〔1～3〕。研究報道，腎小管上皮細胞凋亡是CM致腎損傷和腎衰竭的主要原因〔4〕。彭炎強等〔5〕研究表明，姜黃素能夠通過其抗氧化活性來預防CM對大鼠腎小管上皮細胞損傷，從而預防CIN發生。Yue等〔6〕研究發現阿托伐他汀可通過Toll樣受體(TLR)4/髓樣分化因子(MyD)88信號通路減輕CM引起的急性腎損傷。此外，龔學忠等〔7〕研究報道，制大黃-川芎藥對能通過p38/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制腎小管上皮細胞凋亡進而保護CIN大鼠腎功能。本研究通過CIN大鼠模型來進一步揭示制大黃-川芎藥對緩解CM引起的腎損傷的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 雄性SD大鼠24只，體重(200±20)g購自中科院上海實驗動物中心；消炎痛、Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)均購自Sigma公司；碘海醇(iohexol)購自通用電氣藥業公司；原位末端標記(TUNEL)試劑盒購自美國Roche公司；Bcl-2、Bax、TLR4、Myd88、核轉錄因子(NF)-κB抗體購自CST公司；白細胞介素(IL)-6、IL-1β的酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒購自上海依科賽公司；中藥制大黃、川芎購自內蒙古醫科大學附屬醫院中藥房，水煎濃縮成每毫升含生藥2.25 g備用。

1.2CIN大鼠模型構建 大鼠隨機分為3組，正常對照組(Control組)、CIN模型組(CIN組)、制大黃-川芎藥對組(Drug pair組)。Drug pair組于造模前每日行20倍成人標準體重(60 kg)常規用量的制大黃-川芎水煎液灌胃，連續灌胃7 d；Control組、CIN組分別于造模前行等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)灌胃7 d。7 d后，CIN組和Drug pair組進行CIN模型構建：尾靜脈注射消炎痛(10 mg/kg)，15 min后注射L-NAME(10 mg/kg)，15 min 后注射適量350 mg/ml的碘酒(2 g/kg)，Control組注射等體積的PBS。動物手術實驗均在相應規章制度下進行，并均獲得內蒙古醫科大學附屬醫院動物實驗倫理委員會的批準。

1.3大鼠腎功能指標檢測 造模后24 h后，尾靜脈取血并分離血清，采用全自動生化分析儀測定Scr和尿素氮(BUN)；稱量大鼠體重并記錄，處死大鼠，取腎組織并稱重，計算各組大鼠腎指數。

1.4TUNEL染色 取腎組織固定，石蠟包埋，切片，脫蠟、水合，蛋白酶K處理，加入適量TUNEL工作液，加底物顯色顯微鏡下觀察，細胞核呈棕黃色為凋亡細胞，隨機選取3個視野，以腎小管上皮凋亡陽性細胞占總細胞數的比率為腎小管上皮細胞凋亡率。

1.5Western印跡檢測蛋白表達 將腎組織稱重，加入適量RIPA裂解液冰上研磨，4℃，離心10 min，取上清，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品配成上樣緩沖液并加熱變性，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品并轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后分別用Bcl-2、Bax、TLR4、Myd88、NF-κB和GAPDH一抗及辣根過氧化物酶耦聯的二抗孵育，電化學發光(ECL)液曝光顯影，Image J軟件分析各組樣品相對表達量。

1.6ELISA檢測IL-6、IL-1β表達 根據試劑盒說明，使用大鼠特異的ELISA試劑盒測定IL-6、IL-1β在腎組織中的含量，后將涂層板置于ELISA檢測儀中讀取每個樣品在450 nm處的吸光值，計算樣品含量。

1.7統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組腎病理指標變化比較 與Control組相比，CIN組Scr、BUN和腎指數均顯著升高(均P<0.05)；與CIN組比較，Drug pair組Scr、BUN和腎指數均顯著降低(均P<0.05)，由此得知，制大黃-川芎藥對能夠有效防止造影劑造成的腎功能減弱。見表1。

2.2各組腎小管上皮細胞凋亡率比較 CIN組腎小管細胞凋亡率〔(32.69±5.74)%〕較Control組〔(3.41±0.03)%〕明顯增多(P<0.05)，與CIN組相比，Drug pair組腎小管細胞凋亡明顯減少〔(13.32±1.98)%，P<0.05〕。

2.3各組腎小管上皮細胞凋亡相關蛋白表達比較 與Control組相比，CIN組Bcl-2表達顯著降低，Bax表達顯著升高；Drug pair組較CIN組Bcl-2表達明顯升高，Bax表達明顯降低(均P<0.05)，見圖1、表2。

2.4各組TLR4/Myd88/NF-κB信號蛋白表達比較 與Control組相比，CIN組TLR4、Myd88、NF-κB蛋白表達均顯著升高(P<0.05)；Drug pair組較CIN組TLR4、Myd88、NF-κB蛋白表達均明顯下調(P<0.05)，見圖2、表3。

表1 各組腎病理指標變化

與Control組相比：1)P<0.05；與CIN組相比：2)P<0.05，下表同

圖1 腎組織中Bcl-2、Bax蛋白表達檢測

組別Bcl-2BaxControl組0.32±0.030.11±0.01CIN組0.09±0.011)0.49±0.051)Drug pair組0.21±0.022)0.22±0.022)

圖2 各組腎組織中TLR4/Myd88/NF-κB信號通路蛋白表達檢測

組別TLR4Myd88NF-κBControl組0.88±0.091.36±0.150.83±0.09CIN組1.16±0.121)2.02±0.231)1.12±0.111)Drug pair組0.93±0.082)1.41±0.162)0.91±0.102)

2.5各組炎癥因子IL-6、IL-1β分泌水平比較 與Control組相比，CIN組IL-6、IL-1β分泌顯著增加(均P<0.05)；Drug pair組較CIN組顯著降低了炎性細胞因子IL-6、IL-1β分泌水平(均P<0.05)，見表4。

表4 各組腎組織中炎癥因子IL-6、IL-1β分泌水平水平

3 討 論

CIN是應用CIN時發生的重要并發癥，是繼腎灌注不足和腎毒性藥物之后，第三大醫院獲得性急性腎損傷原因，約占所有醫院獲得性腎衰竭的11%〔8,9〕。臨床上使用等滲和(或)低滲對比劑、加強水合作用、使尿堿化、在手術前24～48 h停止使用腎毒性藥物等措施預防CIN。對于有效預防CIN的藥物，目前研究主要集中在N-乙酰半胱氨酸(NAC)、抗氧化劑(抗壞血酸)、前列腺素E1、腺苷受體抑制劑(茶堿)、低劑量多巴胺、鈣拮抗劑等，但是目前尚無明確的證據支持這些藥物的治療效果和有效劑量〔6,10～12〕。龔學忠等〔4〕發現其能有效抑制CM誘使的腎小管上皮細胞凋亡，保護CIN大鼠腎功能。此外，以制大黃、川芎為主要藥物的經驗方川黃方能有效治療CM導致的急性腎損傷及慢性腎臟病基礎上的急性腎損傷〔3,13〕。

CIN的病理生理學較為復雜，炎癥可能發生在最初的低氧和活性氧(ROS)介導的損傷之后，具有炎癥、血管損傷和缺氧的正反饋循環；與炎癥相關的因素包括釋放氧自由基的氧化應激反應，內皮功能障礙或凋亡及導致腎髓質缺血和缺氧的腎血管收縮〔6〕。研究發現，造影劑可導致腎髓質缺血缺氧，進而導致腎臟脂質過氧化，腎髓質外區氧自由基的產生，從而引起腎小管損傷，且病理檢查顯示管腔、透明管狀物、扁平管狀上皮細胞顯著擴張，并伴有局灶性間質炎癥〔14,15〕，提示CIN發生發展與腎臟炎癥密切相關。

TLR4是在腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞、足細胞和其他腎細胞中表達〔16～19〕，TLR4可能參與了腎間質炎癥的發生和受損腎小管的修復。TLR4在炎癥信號轉導中起重要作用，可通過調節下游信號分子如NF-κB的表達來激活免疫和炎癥反應，進而釋放大量的炎性細胞因子和效應細胞分子，最終導致腎臟炎癥〔20,21〕。TLR4與相應配體的結合觸發下游信號轉導途徑，包括Myd88和Myd88獨立途徑〔22〕。TLR2和TLR4與腎缺血再灌注損傷有關，用脂多糖刺激小鼠腎小管上皮細胞可導致TLR4表達和趨化因子分子分泌增加〔23,24〕。此外，移植有TLR4缺陷型小鼠腎臟的受體正常小鼠無顯著急性腎損傷現象，相反，缺乏TLR4基因的受體小鼠移植了含有正常TLR4基因的小鼠腎臟后則呈現處嚴重的內毒素誘導的急性腎損傷〔25〕。NF-κB可調控炎性細胞因子IL-6和IL-1β的表達〔26〕。本研究結果表明，制大黃-川芎藥對保護CIN具體機制可能與抑制TLR4表達，調節TLR4/Myd88/NF-κB信號轉導，進而降低IL-6、IL-1β等下游炎癥因子的表達來防止腎小管上皮細胞損傷有關。