PTEN蛋白缺失與PI3K抑制劑對非小細胞肺癌的作用

楊軍峰 趙 璞 張 全 務 森

(河南省人民醫院胸外科 ，河南 鄭州 450000)

非小細胞肺癌(NSCLC)發病率和病死率占惡性腫瘤的首位〔1〕。人第10號染色體確實的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)在肺癌磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路中起重要的調節作用，其蛋白表達缺失與NSCLC不良預后相關〔2，3〕。研究發現，3.8%的NSCLC患者的PTEN基因在RNA水平存在大片段缺失，而且大部分缺失與表皮生長因子受體(EGFR)敏感突變共存，表明PTEN缺失在NSCLC發生、發展、治療中不是一種孤立現象，但其失活機制及在通路中的作用仍未闡明〔4〕。本研究擬分析PTEN缺失與PI3K抑制劑對NSCLC細胞系的作用關系，旨在闡釋PTEN缺失的分子機制，為絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)抑制劑的臨床應用篩選合適的分子標記物。

1 材料與方法

1.1細胞株及主要試劑 H1793細胞〔美國物種保存中心(ATCC)〕;PI3K抑制劑GSK2636771(美國MCE公司)；總RNA提取試劑盒(上海超研生物科技有限公司)；RPMI1640培養基、胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；抗體磷酸化(p)-EGFR、p-AKT、P-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)(美國CST公司)；PTEN探針RP11-846G17(多倫多應用基因學，加拿大，光譜標記)；pBP-PTEN質粒(武漢淼靈生物科技有限公司)；DH5α大腸桿菌菌株(本院保存)。其他試劑均為分析純國產試劑。

1.2主要儀器 超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設備有限公司)，精密電子天平(Adventurer公司，美國)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，雙垂直蛋白電泳儀(北京市六一儀器廠)，紫外分光光度計(Nano Drop公司)，酶標儀(Thermo公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3細胞培養 用含100 U/ml青霉素、鏈霉素及10% FBS的RPMI1640培養基，于5% CO2細胞培養箱中37℃培養，0.25%胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察。

1.4基因擴增、轉染、篩選及鑒定 將真核表達載體pBP-PTEN轉化DH5α菌株，克隆并擴增，提取并純化質粒DNA。酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，常規培養。取對數生長期的H1793細胞，采用脂質體介導法將pBP-PTEN質粒轉染入H1793細胞。挑選陽性細胞克隆，擴增培養。將成功轉染pBP-PTEN質粒的H1793細胞命名為H1793-pBP-PTEN細胞。

1.5熒光原位雜交(FISH)法檢測PTEN表達情況 采用PTEN探針RP11-846G17(標記紅色熒光)，按標準FISH操作流程進行檢測。玻片56℃孵育24 h，常規脫蠟、脫水，于80℃檸檬酸鈉緩沖液(SSC)中50 min，SSC漂洗；消化后繼續孵育10 min，梯度灑精脫水，80℃變性后加入探針，37℃過夜，室溫SSC沖洗2 min，水洗，鏡檢。

1.6分組 實驗分為對照組、糖原合成酶(GSK)低劑量組(10 μmol/L)、GSK中劑量組(20 μmol/L)和GSK高劑量組(30 μmol/L)。

1.7MTT比色法檢測細胞增殖情況 配制5 mg/ml的MTT溶液；96孔細胞鋪板，轉染，轉染后24 h、48 h、72 h、96 h檢測MTT，每組設3個復孔；檢測時每孔更換180 μl RMPI1640培養液，再加入20 μl MTT溶液；37℃孵育4 h后，吸出孔內培養基。每孔加入二甲基亞礬(DMSO)150 μl，振搖10 min，490 nm處酶標儀測量OD值。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡 配備10～50 μmol/L 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)溶液，加1/10 DAPI于細胞中，37℃，10～20 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次。用熒光顯微鏡(EX 360 nm，EM 460 nm)觀察。Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測細胞的凋亡指數：把處理的細胞消化、中和、離心、PBS洗2遍，離心去上清，250 μl結合緩沖液重懸，取100 μl加入Annexin V-FITC 5 μl、PI 10 μl,避光室溫15 min后加入PBS 400 μl上機；將Annexin V-FITC/PI加入到孵育緩沖液中，終濃度均為1 μg/ml，用孵育緩沖液洗滌1次，1 000 r/min 離心5 min；用100 μl的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min，1 000 r/min離心5 min沉淀細胞，孵育緩沖液洗1次；加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃孵育20 min，避光并振動；流式細胞儀激發光波長488 nm，用波長515 nm的通帶濾器檢測異硫氰酸熒光素(FITC)熒光，另一波長大于560 nm 的濾器檢測PI。細胞凋亡情況應用Cell Quest 軟件進行分析。

1.9Western印跡法檢測 EGFR信號通路相關蛋白表達 取對數生長期細胞，按照實驗分組預處理細胞24 h，收集細胞，提取蛋白。取35 μg蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜后，用5%脫脂奶粉封閉2 h，將膜轉入一抗(p-EG-FR、 p-AKT、p-mTOR)稀釋液中4℃過夜，PBS洗3次，對應二抗室溫孵育2 h，PBS洗3次，顯影。

1.10統計分析 采用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1PTEN表達情況 PTEN定位于細胞核內，在H1793細胞內為陰性表達，在H1793-pBP-PTEN細胞內呈陽性表達，顯紅色熒光，證實PTEN成功轉入H1793細胞并獲得表達。見圖1。

圖1 PTEN的表達(×400)

2.2PI3K抑制劑對細胞增殖的影響 PI3K抑制劑作用72 h后，相同濃度PI3K抑制劑對H1793細胞株和H1793-pBP-PTEN細胞株的抑制率比較存在顯著性差異(P<0.05)。GSK高劑量組對H1793細胞株和H1793-pBP-PTEN細胞株的抑制率高于GSK低劑量組和GSK中劑量組(P<0.05)，GSK中劑量組對H1793細胞株和H1793-pBP-PTEN細胞株的抑制率高于GSK低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 PI3K抑制劑作用72 h后的A值和抑制率

與GSK高劑量組比較：1)P<0.05；與GSK中劑量組比較：2)P<0.05

2.3PI3K抑制劑對細胞凋亡的影響 處理48 h后GSK低、中和高劑量組H1793細胞株凋亡率分別為8.22%、12.12%和18.93%，H1793-pBP-PTEN細胞株凋亡率分別為18.29%、26.83%和39.67%。相同濃度PI3K抑制劑作用下，H1793細胞株和H1793-pBP-PTEN細胞株的凋亡率比較差異顯著(P<0.05)。GSK高劑量組對H1793細胞株和H1793-pBP-PTEN細胞株的凋亡率高于GSK低劑量組和GSK中劑量組(P<0.05)，GSK中劑量組對H1793細胞株和H1793-pBP-PTEN細胞株的凋亡率高于GSK低劑量組。

2.4PI3K抑制劑對信號通路的影響 隨著PI3K抑制劑濃度增加，H1793細胞株和H1793-pBP-PTEN細胞株 p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平均下降，且H1793-pBP-PTEN細胞株p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平顯著低于H1793細胞株(P<0.05)。GSK低劑量組H1793細胞株和H1793-pBP-PTEN細胞p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平均高于GSK中劑量組和GSK中劑量組(P<0.05)，GSK中劑量組H1793細胞株和H1793-pBP-PTEN細胞p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平均高于GSK高劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 PI3K抑制劑對信號通路的影響

與H1793細胞株比較:1)P<0.05；與GSK高劑量組比較：2)P<0.05；與GSK中劑量組比較：3)P<0.05

3 討 論

著名的吉非替尼(易瑞沙)泛亞洲研究(IPASS)為肺癌靶向治療樹立了里程碑，EGFR突變型NSCLC患者采用小分子酪氨酸激酶抑制劑靶向治療臨床療效十分顯著〔5〕。研究顯示，靶向藥克唑替尼對微管相關類蛋白樣(EML)4間變淋巴瘤激酶(ALK)融合基因突變的NSCLC患者同樣效果顯著。由此可見，基于分子靶點的靶向抑制劑治療已發展成肺癌“個體化”治療的有效模式，EGFR突變型肺癌、EML4-ALK融合型肺癌做為明確的肺癌分子亞型，單一的病理分型已不能滿足臨床需要〔6〕。驅動因子及其分子機制研究在肺癌的發生、發展過程中取得喜人的進展，發現了許多藥物治療靶點，為NSCLC治療提供多種選擇。

國內外均報道了NSCLC的基因突變譜，50%的肺腺癌伴有驅動基因的突變，為NSCLC的靶向治療提供了分子基礎〔7〕。有報道稱，在50%的NSCLC患者中含成纖維細胞生長因子受體(FGFR)1擴增、盤狀結構域受體(DDR)2突變或PIK3CA 突變/PTEN缺失，提示這幾個基因可能是NSCLC發生、發展的主要驅動因子，也可能成為靶向藥物治療的靶點〔8〕。EGFR是目前倍受矚目的腫瘤治療靶點。EGFR通過RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK通路和PI3K/AKT兩條通路參與調控細胞的生長和分化，這兩條通路的失調控可導致腫瘤的發生、發展。PTEN基因包含一個與脂質結合的C2區，一個氨基端磷酸酶區域和一個羧基端區域。PTEN基因cDNA 5′末端存在著由近804個核苷酸組成的非翻譯區，并含有許多基因啟動子區域CpG雙核苷酸島結構，可為其發生DNA甲基化提供可能〔9，10〕。

本研究顯示，PI3K抑制劑GSK2636771可顯著抑制H1973細胞增殖，促使腫瘤細胞凋亡。H1973 細胞為PTEN表達缺失的肺癌細胞株，通過脂質體介導法成功將pBP-PTEN質粒轉染入H1973腫瘤細胞，PI3K抑制劑的抑制細胞增殖和促凋亡作用得到增強，提示PTEN在PI3K抑制劑抗腫瘤作用中扮演重要角色，其表達缺失預示著肺癌H1973 細胞對PI3K抑制劑不敏感。因此，檢測NSCLC患者PTEN基因表達水平對評估PI3K抑制劑治療療效及預后有重要意義。

PI3K/AKT/mTOR信號傳導通路通過調控下游分子，參與調節基因轉錄、翻譯、細胞凋亡及細胞周期，在多種腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用〔11，12〕。作為一個抑癌基因，PTEN可抑制腫瘤的進展，負調節蛋白激酶信號級聯作用。PTEN的磷酸化區域是腫瘤抑制子活性區，但其關鍵作用是脂磷酸化作用，而不是蛋白磷酸化作用〔13〕。實驗證實，PTEN主要通過其脂質磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子PIP3從而阻斷PI3K/AKT信號通路實現抑癌作用，故有學者將其稱為PTEN-PI3K/AKT信號轉導通路〔14〕。此外，AKT是PTEN的一個重要作用靶點，PTEN缺失是AKT失調控的一個重要原因。AKT的活化在肺癌的形成和進展中起重要作用，因此，AKT是腫瘤治療的靶點〔15，16〕。本研究結果顯示，PI3K抑制劑對H1793-pBP-PTEN細胞株PI3K/AKT/mTOR信號抑制作用更明顯。