菟絲子提取物對自然衰老小鼠學習記憶能力及肝和腦組織ATP酶活力的影響

劉海云 紀玉龍 何志堅

(江西中醫藥大學基礎醫學院，江西 南昌 330004)

衰老是一個復雜多變的生物學過程，隨著年齡的增長，機體在成年以后即使在正常狀態下也會發生一系列形態結構的變化和機體功能的減退，并逐漸走向死亡的不可逆轉的現象〔1〕。中藥菟絲子是一年生攀緣性的草本寄生性種子植物，是一種常用補陽藥物，性平、味辛甘，歸腎、肝、脾經，具有補腎益精、養肝明目、固精縮尿、安胎止瀉的功效〔2〕。自由基學說是衰老的一個討論熱點，本實驗觀察中藥菟絲子對自然衰老小鼠學習記憶能力及過氧化脂質(LPO)水平、過氧化氫酶(CAT)活性和肝腦組織中ATP酶活力的影響并分析其抗衰老作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 昆明種老齡小鼠(12～14月齡)40只,青齡組小鼠(3～4月齡)10只，小鼠由江西中醫藥大學實驗動物中心提供，雌雄各半，許可證號SYXK(贛)2015-0026。室溫20 ～ 22 ℃，空氣新鮮，通風良好，小鼠雌雄分籠固體飼料喂養,自由飲水，正式開始實驗前適當飼養7 d左右。

1.2試劑 CAT試劑盒、LPO試劑盒、ATP酶活力試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，批號依次為20150121、20150217、20150214。中藥菟絲子購于南昌開心人大藥房。

1.3儀器 微量進樣器(德國Eppendorf公司),恒溫水浴鍋(金壇市榮華儀器制造有限公司)，AdventurerTM電子天平(奧豪斯國際貿易有限公司)，TGL-16G型臺式高速離心機(上海市實驗儀器總廠)，TECAN酶標儀sunrise(奧地利TECAN公司)

1.4菟絲子提取物的制備〔3〕稱取菟絲子中藥250 g，加入2 000 ml水浸泡120 min，至菟絲子藥材微脹，微火煎煮2次，每次煎煮時間30 min，過濾2次提取液合并一起，至水浴鍋中濃縮至生藥濃度為0.4 g/ml，放于西門子冰箱冷藏，備用。

1.5動物分組與給藥 昆明種老齡小鼠，隨機分為衰老模型組、低、中、高劑量給藥組(菟絲子100、200、300 mg·kg-1·d-1劑量組各10只；青齡組為正常對照組。菟絲子低劑量、中劑量和高劑量每天灌胃給藥1次,正常對照組和衰老模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃，持續7 w。

1.6學習記憶能力測試 Y迷宮行為學的觀察參照文獻〔4〕。在MG-2型Y迷宮(規格100 mm×150 mm×250 mm)內，分安全區(A)、電擊區(B)和起步區(C)。在實驗測試時接通電流給予小鼠電刺激，小鼠從C區接受電擊刺激后，能一次性從C區直接跳到A區為正確反應，否則屬錯誤反應。通過觀察它能否有效避開并正確找到安全區來判斷小鼠的學習和記憶能力。實驗小鼠最后一次給藥60 min后,開始進行學習記憶能力訓練，首先把小鼠放入Y迷宮并讓其適應6～8 min，再把小鼠放進起步區，接通電流，記錄小鼠接受電擊后的反應，并記錄其結果。注意兩次電擊訓練之間讓小鼠休息1 min。如果連續訓練10次都對或者9次正確即為小鼠已經學會空間辨認。達標時所需的訓練次數作為學習成績。1 d后用相同的訓練方法再訓練，訓練時的錯誤次數記為記憶成績。

1.7肝腦組織及血清的制備 最后一次給藥0.5 h后眼眶取血，放于離心機3 000 r/min離心10 min，微量加樣器吸取上清液備用。取血后的小鼠迅速放置于冰上，快速取出肝臟和腦組織,用4℃的生理鹽水反復沖洗2～3次，洗掉表面的殘血，濾紙拭干后,稱其重量,剪碎組織放入勻漿瓶中，按重量體積比加9倍生理鹽水勻漿10 min，配成10%腦組織和肝臟勻漿液,然后以1 500 r/min離心10 min,取其上清液，再用生理鹽水把上清液稀釋為濃度為2%組織勻漿，-70℃保存備用。

1.8肝腦組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活力的測定 取稀釋好的組織勻漿按試劑盒步驟進行操作。

1.9統計處理 采用SPSS17.0軟件進行LSD法分析。

2 結 果

2.1各組學習記憶能力 衰老模型組與正常對照組相比，學習達標次數和記憶錯誤次數均增多(P<0.01)；給藥組與衰老模型組相比，學習和記憶錯誤次數減少，以中、高劑量組效果明顯(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2各組肝和腦組織中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力 與正常對照組比較，衰老模型組ATP酶活力顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與衰老模型組比較，低、中、高劑量給藥組臟、腦組織ATP酶活力均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見表2,表3。

表1 各組學習記憶能力次)

與正常對照組比較：1)P<0.01；與衰老模型組相比：2)P<0.01，3)P<0.05；表4同

表2 各組肝組織ATP酶活力

與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組相比：3)P<0.05，4)P<0.01；表3同

表3 各組腦組織ATP酶活力

2.3各組血清中CAT活力、LPO含量 與正常對照組相比，衰老模型組血清中CAT活力均顯著降低而LPO含量顯著升高(P<0.01)；與衰老模型組比較，低、中、高劑量給藥組血清中CAT活力均顯著升高而LPO含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表4。

表4 各組血清中CAT活力、LPO含量

3 討 論

自由基學說是目前衰老學說機制中被認可的一種〔5〕，該學說提出了衰老與自由基關系密切，在正常生理活動過程中細胞會產生自由基，自由基生成過多不能及時清除而導致自由基不斷堆積，生成大量的過氧化物，最終加速了細胞衰老并可能進一步導致其死亡〔6〕。本實驗證實中藥菟絲子可以清除產生的過多自由基，直接或間接降低了自由基對機體的損害,從而保護機體組織因抗氧化性物質消耗造成的損傷,從而達到抗衰老的作用。 ATP酶是一種輔酶，作為能量產生的必需生理物質，可參與機體三大物質(糖、蛋白質、脂肪)及核酸、核苷酸等代謝過程，又可以改善機體代謝。因此ATP酶的活力可準確衡量細胞代謝相關的生命活動，是衡量細胞衰老的最重要指標之一。本文表明，處于自然衰老狀態的小鼠腦組織中Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPsae活性呈下降的趨勢，這與文獻報道基本一致〔7〕。Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase是細胞膜上的一類蛋白質，它可以調節細胞內外離子的濃度，可以將細胞內的鈣離子運輸到細胞外，從而保持細胞內、外處于鈣穩定狀態。隨著年齡增大，Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性降低，勢必會引起這一穩態的失衡，不能保持細胞內低鈣離子濃度，導致細胞內鈣離子濃度超標，加速了細胞的衰老〔8〕，雖然肝腦組織中ATP酶活性受多方面因素的影響，但在降低ATP酶活性方面自由基損傷是最重要的指標之一。本文結果表明，菟絲子取物對自然衰老小鼠肝腦組織ATP酶活性有明顯的增強效果，從而進一步起到延緩衰老的作用。

CAT存在于細胞膜上，可以對抗自由基，將體內H2O2分解為水而被清除，從而降低體內自由基的生成而減少自由基堆積〔9〕。LPO可以讓細胞功能下降，是細胞膜上不飽和脂肪酸與氧自由基相互作用生成的脂質過氧化產物，破壞細胞膜的結構，從而使細胞失去活性，導致機體細胞死亡〔10〕。正常情況下，機體代謝過程中由于抗氧化能力降低造成體內自由基物質增加，包括H2O2和羥自由基等，自由基可以氧化細胞膜中不飽和脂肪酸，從而形成過氧化脂質加速機體的衰老〔11〕。本實驗結果表明菟絲子提取物可提高體內抗氧化酶活性，減少脂質過氧化產生，增強體內自身抗氧化能力，對延緩衰老能起到一定的積極作用。