五味子多糖對(duì)SHG-44細(xì)胞產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和Caspase-8的影響

唐澤波 劉永嬌 陳默然 牛艷霞 李卓亞 齊 玲 溫 娜

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，據(jù)調(diào)查〔1〕，中國(guó)的原發(fā)性腦腫瘤發(fā)病率為22.52/10萬(wàn)，其中膠質(zhì)瘤占29.78%。近年膠質(zhì)瘤的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)〔2〕，嚴(yán)重威脅患者的生命，并給患者家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)〔3〕，目前仍缺乏有效的治療藥物。因此，尋找有效的抗腫瘤藥物是目前的研究熱點(diǎn)〔4〕。五味子是我國(guó)著名的滋補(bǔ)性傳統(tǒng)中藥〔5〕，抗腫瘤活性成分主要集中在多糖和木脂素〔6〕。有研究〔7，8〕表明，五味子多糖(CPSC) 能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞等發(fā)生凋亡。另外，腫瘤的生長(zhǎng)需要新生血管提供所需的氧和營(yíng)養(yǎng)，因此血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)量是腫瘤生長(zhǎng)的標(biāo)志之一。本研究擬采用膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞，檢測(cè)CPSC對(duì)VEGF和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-8產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 CPSC(北華大學(xué)提供)，人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞(吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科提供)，培養(yǎng)基RPMI1640 (美國(guó)Hyclone公司)，小牛血清、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，MTT(美國(guó)Sigma)，VEGF兔抗人多克隆抗體(北京中杉金橋公司)，Caspase-8抗體(Cell Signaling公司)。CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)MDC公司)。

1.2SHG-44細(xì)胞的培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞復(fù)蘇后，放入含10%小牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，將其置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液〔9〕。

1.3MTT法檢測(cè)CPSC對(duì)SHG-44細(xì)胞增殖活性的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG-44細(xì)胞消化后，用含5%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl，并置入5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入不同濃度的CPSC (50、100和200 mg/L)，每個(gè)藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別作用24、48、72 h后棄去上清液，每孔加入MTT 20 μl繼續(xù)孵育4 h，棄上清后每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩均勻，15 min后全自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)值，以不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零〔10〕。

1.4酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞上清液中VEGF和Caspase-8蛋白表達(dá) 將SHG-44細(xì)胞消化，加入含5%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液并接種于24孔板中，分為對(duì)照組(只加5%基礎(chǔ)培養(yǎng)基)和藥物組(50、100、200 mg/L CPSC)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。72 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，按1∶1的比例將上清液與包被液加入96孔酶標(biāo)板中，對(duì)照組為100%包被液，4℃過(guò)夜。1%牛血清白蛋白(BSA)封閉液37℃孵育1 h。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗板后分別加入VEGF和Caspase-8抗體(1∶500稀釋)4℃孵育過(guò)夜。PBST洗板后加入二抗(1∶1 000稀釋)，室溫下孵育2 h。PBST洗板，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液室溫避光3～5 min，當(dāng)有顏色變化時(shí)終止反應(yīng)。全自動(dòng)酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)定吸光度(A)值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算〔10〕。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞增殖活性變化 CPSC作用不同時(shí)間，膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖反應(yīng)不一；但是，CPSC高濃度、作用時(shí)間長(zhǎng)時(shí)表現(xiàn)為明顯的抑制作用。與對(duì)照組比較，作用24 h時(shí)，CPSC各濃度組SHG-44細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)，其中，200 mg/L CPSC組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；作用48、72 h時(shí)，CPSC各濃度組SHG-44細(xì)胞的增殖活性均明顯受到抑制，與對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。由于72 h作用最明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用這一時(shí)間。

表1 各組SHG-44細(xì)胞增殖活性值)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2各組 SHG-44細(xì)胞分泌VEGF和Caspase-8蛋白水平比較 50、100、200 mg/L CPSC作用SHG-44細(xì)胞72 h后，與對(duì)照組比較，各濃度CPSC組VEGF蛋白差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；Caspase-8蛋白分泌水平升高，與對(duì)照組比較，各濃度CPSC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組VEGF和Caspase-8蛋白水平比較

3 討 論

膠質(zhì)瘤占所有顱內(nèi)腫瘤的12%～15%〔11〕，具有攻擊性、致命性和高度侵入性的特點(diǎn)〔12〕。腫瘤的生長(zhǎng)所需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)必須從腫瘤的新生血管中獲得，如果沒(méi)有新的血管生成，即使1 mm3以上實(shí)體瘤也會(huì)因缺乏氧氣和營(yíng)養(yǎng)而發(fā)生休眠、壞死或凋亡〔13，14〕。因此，新生血管的形成是腫瘤生長(zhǎng)的必要條件〔15〕。目前認(rèn)為，VEGF是調(diào)節(jié)腫瘤血管生長(zhǎng)最重要的因子之一〔16〕。有研究〔17〕表明，膠質(zhì)瘤的惡性程度與VEGF的表達(dá)有關(guān)，且呈正相關(guān)，惡性程度越高，瘤組織中VEGF的含量越多。因此，抑制VEGF生成和表達(dá)對(duì)抗膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CPSC在不同時(shí)間對(duì)SHG-44細(xì)胞增殖活性的影響不盡相同，但當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)達(dá)到48 h后，CPSC則表現(xiàn)出對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各濃度CPSC組的VEGF蛋白含量明顯降低。以上結(jié)果提示，CPSC可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖，這可能是通過(guò)下調(diào)VEGF而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。但是，CPSC下調(diào)SHG-44細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的機(jī)制目前尚不清楚。有研究〔18〕表明：抗氧化劑柚皮素抑制VEGF蛋白表達(dá)，活性氧能增加VEGF基因表達(dá)。因此推測(cè)：CPSC抑制VEGF蛋白表達(dá)可能與其抗氧化作用有關(guān)，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

腫瘤的發(fā)生也可能與腫瘤細(xì)胞凋亡受阻有關(guān)〔19，20〕。細(xì)胞凋亡是在一系列基因控制下的程序化死亡，包括死亡受體途徑和線粒體途徑，其中Caspase-8活化是死亡受體和線粒體兩個(gè)途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。當(dāng)Caspase-8活化后，可激活下游的效應(yīng)因子如Caspase-3等，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，目前認(rèn)為，在眾多的凋亡相關(guān)蛋白中，Caspase是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。本文結(jié)果說(shuō)明，CPSC可能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生。總之，CPSC具有抑制膠質(zhì)瘤增殖的作用，并且，它可能是通過(guò)抑制VEGF分泌、促進(jìn)Caspase-8產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致其增殖受抑制。