乳腺癌腫瘤微環境中HMGB1蛋白及HMGB1/TLR4信號通路的水平

梁 曦 張成華 房明麗 王書君 王 澍 趙海東 張 樂

(大連醫科大學附屬第二醫院乳腺外科，遼寧 大連 116021)

高遷移率族蛋白(HMGB)1是一種廣泛存在于真核細胞內的非組蛋白〔1〕，正常情況下作為一種DNA結合蛋白調節著多種基因的轉錄與表達〔2〕。當機體感染病毒時，HMGB1可由激活的免疫細胞(包括單核/巨噬細胞、樹突細胞(DC)等〕主動分泌，或由壞死的細胞被動釋放〔3,4〕，釋放到細胞外的HMGB1作為一種炎癥因子與細胞膜上的受體〔如Toll樣受體(TLR)4,糖基化終末產物(RAGE)〕結合誘導機體發生炎癥反應〔5,6〕。研究顯示，HMGB1在乳腺癌組織的表達明顯升高〔7〕。腫瘤組織細胞質中HMGB1水平越高，組織中浸潤的淋巴細胞越多〔8〕。腫瘤細胞釋放的HMGB1可抑制傳統的殺傷性T細胞從而促進腫瘤生長。除此之外，釋放到細胞外的HMGB1還可以與免疫調節性T細胞(Treg)表面的TLR4和RAGE配體結合，進而激活Treg細胞并釋放白細胞介素(IL)-10等細胞因子促進腫瘤細胞免疫逃逸,進而促進腫瘤生長〔9〕。另有相反的研究顯示：放療或抗腫瘤治療殺傷的腫瘤細胞釋放的HMGB1，可以與成熟DC細胞表面的TLR2或TLR4手提結合激活天然免疫，進而發揮抗腫瘤的免疫功能〔10,11〕。本研究主要探討不同臨床分期乳腺癌組織細胞質中HMGB1及其信號通路HMGB1/TLR4的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選擇大連醫科大學附屬第二醫院2015年9～12月行乳腺癌根治術的手術標本52例，均為女性，年齡55～65歲,均經病理確診。淋巴結轉移22例，遠端轉移17例，無轉移13例；按國際抗癌聯盟(UICC)-TNM標準臨床分期,Ⅰ期13例,Ⅱ期22例,Ⅲ+Ⅳ17例;組織病理分級為低分化16例、中分化22例、高分化14例;另取癌旁組織10例作為正常對照。

1.2實驗材料 HMGB1單克隆抗體(貨號ab18256,abcam公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號：60004-1 Proteintech公司)；逆轉錄試劑盒(貨號AE301,TransGen Biotech公司);熒光定量PCR試劑盒(貨號：AQ131；TransGen Biotech公司)；羊抗兔二抗-辣根過氧化物酶(HRP)二抗(貨號ab6721,abcam公司)；NE-PER 核漿分離試劑盒(貨號78833，Termo Scientific)；電化學發光(ECL)Western印跡試劑盒 (美國Pierce公司)。

1.3組織總RNA提取及定量PCR檢測 手術時切除不同臨床分期腫瘤組織或癌旁組織作為檢測標本，分別取檢測組織約100 mg放到1 ml的Trizol試劑中，根據說明書提取總RNA后逆轉錄成cDNA,采用qRT-PCR方法測定HMGB1、RAGE、TLR4的表達，以GAPDH作為內參。25 μl反應體系，擴增條件為：94℃預變性4 min，94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s。 35個循環。根據各目的基因的CT值，用2-ΔΔCt法〔12〕比較Ct值，計算腫瘤組織組HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA相對于癌旁組織的表達量。

1.4引物的設計和合成 根據美國國立生物技術信息中心Genebank數據庫，搜索人HMGB1、RAGE、TLR4和GAPDH的cDNA序列。設計引物：HMGB1正義鏈：5′-GCATGGGCAAAGGAGATCCTAA-3′，反義鏈：5′-TTAGCAGACATGGTCTTCCAC-3′；RAGE正義鏈：5′-GCTCTTCACACTGCAGTCGG-3′，反義鏈：5′-GAGCTACTGCTCCACCTTCT-3′；TLR4正義鏈：5′-GGTCAGACGGTGATAGCGAG-3′，反義鏈：5′-GGATTTCACACCTCCACGCA-3′；GAPDH正義鏈：5′-AATGACCCCTTCATTGAC-3′，反義鏈：5′-TCCACGACGTACTCAGCGC-3′。設計的引物由上海生物工程合成。

1.5Western印跡檢測腫瘤組織細胞質內HMGB1蛋白水平 NE-PER 核質分離試劑盒裂解液提取不同臨床分期腫瘤組織或癌旁組織中細胞質中的總蛋白(參照說明書)。將提取的蛋白質進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),蛋白質樣品每泳道上樣量均為100 μg,電泳后進行聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜,BSA室溫封閉2 h,1∶1 000稀釋HMGB1抗體,4℃過夜孵育，洗膜，HRP標記的羊抗兔抗體(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜，ECL法顯色，照相。用計算機圖像分析系統掃描條帶的灰度值，然后計算每個標本中HMGB1蛋白的相對表達量(HMGB1/GAPDH比值)。

1.6統計學分析 應用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1不同臨床分期乳腺癌組織細胞質中HMGB1蛋白的表達 Ⅰ期(1.09±0.18)與Ⅱ期(0.93±0.12)乳腺癌組織細胞質中的HMGB1蛋白明顯高于癌旁組織(0.57±0.05,P<0.05)。而與癌旁組織相比，Ⅲ+Ⅳ期(0.65±0.11)乳腺癌組織細胞質中的HMGB1蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

1：癌旁組織；2：Ⅰ期乳腺癌組織；3：Ⅱ期乳腺癌組織；4：Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組織圖1 乳腺癌組織和癌旁組織HMGB1的表達

2.2乳腺癌組織與癌旁組織中HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA水平比較 癌旁組織HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA水平分別為：1.13±0.16、1.00±0.18、1.06±0.12；乳腺癌組織分別為：1.63±0.25、1.66±0.24、1.52±0.20。與癌旁組織相比，乳腺癌組織中HMGB1和RAGE的mRNA水平均明顯增高(均P<0.01)。

2.3不同臨床分期乳腺癌組織中HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA水平比較 Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組織中HMGB1 mRNA水平分別為：1.48±0.11、1.69±0.30、1.72±0.26；RAGE mRNA水平分別為：1.57±0.12、1.71±0.31、1.68±0.21；TLR4 mRNA水平分別為：1.52±0.15、1.53±0.22、1.50±0.23。Ⅱ期乳腺癌及Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組織中HMGB1 mRNA水平明顯高于Ⅰ期(均P<0.05)。HMGB1的表達水平與腫瘤的分期具有相關性。 但Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組織中的RAGE和TLR4 mRNA水平與Ⅰ期相比差異無統計學意義(均P>0.05)。

3 討 論

HMGB1 廣泛表達于多種組織細胞，具有調節基因轉錄、穩固細胞核結構的功能，同時也是一種重要的損傷相關的分子識別模式(DAMPs)〔13〕。細胞核內的HMGB1蛋白可由細胞核遷移到細胞質，并釋放到細胞外〔14〕。免疫細胞主動分泌或壞死細胞被動釋放到細胞外的HMGB1通過與其配體 RAGE或TLR2、TLR4和TLR9結合發揮免疫應答調節作用〔15〕,也參與腫瘤的發生、發展〔7〕。HMGB1蛋白在腫瘤發生過程中具有雙重的作用。HMGB1通過RAGE蛋白促進腫瘤組織中血管的生成〔16〕，進而促進腫瘤的發生。如果抑制HMGB1-RAGE的相互作用可以通過抑制核轉錄因子(NF)-κB信號通路進而抑制腫瘤的生長和轉移。研究顯示，HMGB1蛋白具有抗腫瘤的作用。腫瘤細胞胞質內高水平的HMGB1蛋白能夠促進DC細胞和淋巴細胞浸潤到腫瘤組織中發揮抗腫瘤作用〔17〕。本研究結果說明乳腺癌早期HMGB1蛋白位于細胞質中，中晚期乳腺癌細胞中HMGB1蛋白以分泌到細胞外。同時，本研究發現腫瘤組織中RAGE和TLR4的的mRNA水平遠遠高于正常組織。說明中晚期乳腺癌組織分泌到細胞外的HMGB1蛋白通過其配體RAGE和TLR4相合促進了腫瘤的發生、發展，與Taguchi等〔18〕研究結果相類似，他們發現壞死的腫瘤細胞釋放的HMGB1與其配體RAGE結合后激活HMGB1-RAGE信號通路促進腫瘤的浸潤與轉移。綜上，乳腺癌組織細胞質中HMGB1蛋白水平與乳腺癌的進展密切相關，該蛋白可能發展成為判斷乳腺癌預后的一個臨床標志。