乳腺癌腫瘤微環(huán)境中HMGB1蛋白及HMGB1/TLR4信號通路的水平

梁 曦 張成華 房明麗 王書君 王 澍 趙海東 張 樂

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院乳腺外科，遼寧 大連 116021)

高遷移率族蛋白(HMGB)1是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白〔1〕，正常情況下作為一種DNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)著多種基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)〔2〕。當(dāng)機(jī)體感染病毒時(shí)，HMGB1可由激活的免疫細(xì)胞(包括單核/巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)等〕主動分泌，或由壞死的細(xì)胞被動釋放〔3,4〕，釋放到細(xì)胞外的HMGB1作為一種炎癥因子與細(xì)胞膜上的受體〔如Toll樣受體(TLR)4,糖基化終末產(chǎn)物(RAGE)〕結(jié)合誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)〔5,6〕。研究顯示，HMGB1在乳腺癌組織的表達(dá)明顯升高〔7〕。腫瘤組織細(xì)胞質(zhì)中HMGB1水平越高，組織中浸潤的淋巴細(xì)胞越多〔8〕。腫瘤細(xì)胞釋放的HMGB1可抑制傳統(tǒng)的殺傷性T細(xì)胞從而促進(jìn)腫瘤生長。除此之外，釋放到細(xì)胞外的HMGB1還可以與免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)表面的TLR4和RAGE配體結(jié)合，進(jìn)而激活Treg細(xì)胞并釋放白細(xì)胞介素(IL)-10等細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長〔9〕。另有相反的研究顯示：放療或抗腫瘤治療殺傷的腫瘤細(xì)胞釋放的HMGB1，可以與成熟DC細(xì)胞表面的TLR2或TLR4手提結(jié)合激活天然免疫，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的免疫功能〔10,11〕。本研究主要探討不同臨床分期乳腺癌組織細(xì)胞質(zhì)中HMGB1及其信號通路HMGB1/TLR4的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選擇大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2015年9～12月行乳腺癌根治術(shù)的手術(shù)標(biāo)本52例，均為女性，年齡55～65歲,均經(jīng)病理確診。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移17例，無轉(zhuǎn)移13例；按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)-TNM標(biāo)準(zhǔn)臨床分期,Ⅰ期13例,Ⅱ期22例,Ⅲ+Ⅳ17例;組織病理分級為低分化16例、中分化22例、高分化14例;另取癌旁組織10例作為正常對照。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 HMGB1單克隆抗體(貨號ab18256,abcam公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號：60004-1 Proteintech公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號AE301,TransGen Biotech公司);熒光定量PCR試劑盒(貨號：AQ131；TransGen Biotech公司)；羊抗兔二抗-辣根過氧化物酶(HRP)二抗(貨號ab6721,abcam公司)；NE-PER 核漿分離試劑盒(貨號78833，Termo Scientific)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)Western印跡試劑盒 (美國Pierce公司)。

1.3組織總RNA提取及定量PCR檢測 手術(shù)時(shí)切除不同臨床分期腫瘤組織或癌旁組織作為檢測標(biāo)本，分別取檢測組織約100 mg放到1 ml的Trizol試劑中，根據(jù)說明書提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用qRT-PCR方法測定HMGB1、RAGE、TLR4的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參。25 μl反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s。 35個循環(huán)。根據(jù)各目的基因的CT值，用2-ΔΔCt法〔12〕比較Ct值，計(jì)算腫瘤組織組HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA相對于癌旁組織的表達(dá)量。

1.4引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心Genebank數(shù)據(jù)庫，搜索人HMGB1、RAGE、TLR4和GAPDH的cDNA序列。設(shè)計(jì)引物：HMGB1正義鏈：5′-GCATGGGCAAAGGAGATCCTAA-3′，反義鏈：5′-TTAGCAGACATGGTCTTCCAC-3′；RAGE正義鏈：5′-GCTCTTCACACTGCAGTCGG-3′，反義鏈：5′-GAGCTACTGCTCCACCTTCT-3′；TLR4正義鏈：5′-GGTCAGACGGTGATAGCGAG-3′，反義鏈：5′-GGATTTCACACCTCCACGCA-3′；GAPDH正義鏈：5′-AATGACCCCTTCATTGAC-3′，反義鏈：5′-TCCACGACGTACTCAGCGC-3′。設(shè)計(jì)的引物由上海生物工程合成。

1.5Western印跡檢測腫瘤組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)HMGB1蛋白水平 NE-PER 核質(zhì)分離試劑盒裂解液提取不同臨床分期腫瘤組織或癌旁組織中細(xì)胞質(zhì)中的總蛋白(參照說明書)。將提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),蛋白質(zhì)樣品每泳道上樣量均為100 μg,電泳后進(jìn)行聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜,BSA室溫封閉2 h,1∶1 000稀釋HMGB1抗體,4℃過夜孵育，洗膜，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜，ECL法顯色，照相。用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)掃描條帶的灰度值，然后計(jì)算每個標(biāo)本中HMGB1蛋白的相對表達(dá)量(HMGB1/GAPDH比值)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同臨床分期乳腺癌組織細(xì)胞質(zhì)中HMGB1蛋白的表達(dá) Ⅰ期(1.09±0.18)與Ⅱ期(0.93±0.12)乳腺癌組織細(xì)胞質(zhì)中的HMGB1蛋白明顯高于癌旁組織(0.57±0.05,P<0.05)。而與癌旁組織相比，Ⅲ+Ⅳ期(0.65±0.11)乳腺癌組織細(xì)胞質(zhì)中的HMGB1蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

1：癌旁組織；2：Ⅰ期乳腺癌組織；3：Ⅱ期乳腺癌組織；4：Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組織圖1 乳腺癌組織和癌旁組織HMGB1的表達(dá)

2.2乳腺癌組織與癌旁組織中HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA水平比較 癌旁組織HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA水平分別為：1.13±0.16、1.00±0.18、1.06±0.12；乳腺癌組織分別為：1.63±0.25、1.66±0.24、1.52±0.20。與癌旁組織相比，乳腺癌組織中HMGB1和RAGE的mRNA水平均明顯增高(均P<0.01)。

2.3不同臨床分期乳腺癌組織中HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA水平比較 Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組織中HMGB1 mRNA水平分別為：1.48±0.11、1.69±0.30、1.72±0.26；RAGE mRNA水平分別為：1.57±0.12、1.71±0.31、1.68±0.21；TLR4 mRNA水平分別為：1.52±0.15、1.53±0.22、1.50±0.23。Ⅱ期乳腺癌及Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組織中HMGB1 mRNA水平明顯高于Ⅰ期(均P<0.05)。HMGB1的表達(dá)水平與腫瘤的分期具有相關(guān)性。 但Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌組織中的RAGE和TLR4 mRNA水平與Ⅰ期相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

3 討 論

HMGB1 廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)固細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的功能，同時(shí)也是一種重要的損傷相關(guān)的分子識別模式(DAMPs)〔13〕。細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1蛋白可由細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)，并釋放到細(xì)胞外〔14〕。免疫細(xì)胞主動分泌或壞死細(xì)胞被動釋放到細(xì)胞外的HMGB1通過與其配體 RAGE或TLR2、TLR4和TLR9結(jié)合發(fā)揮免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)作用〔15〕,也參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔7〕。HMGB1蛋白在腫瘤發(fā)生過程中具有雙重的作用。HMGB1通過RAGE蛋白促進(jìn)腫瘤組織中血管的生成〔16〕，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。如果抑制HMGB1-RAGE的相互作用可以通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路進(jìn)而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。研究顯示，HMGB1蛋白具有抗腫瘤的作用。腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)高水平的HMGB1蛋白能夠促進(jìn)DC細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤到腫瘤組織中發(fā)揮抗腫瘤作用〔17〕。本研究結(jié)果說明乳腺癌早期HMGB1蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中，中晚期乳腺癌細(xì)胞中HMGB1蛋白以分泌到細(xì)胞外。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中RAGE和TLR4的的mRNA水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織。說明中晚期乳腺癌組織分泌到細(xì)胞外的HMGB1蛋白通過其配體RAGE和TLR4相合促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與Taguchi等〔18〕研究結(jié)果相類似，他們發(fā)現(xiàn)壞死的腫瘤細(xì)胞釋放的HMGB1與其配體RAGE結(jié)合后激活HMGB1-RAGE信號通路促進(jìn)腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。綜上，乳腺癌組織細(xì)胞質(zhì)中HMGB1蛋白水平與乳腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)，該蛋白可能發(fā)展成為判斷乳腺癌預(yù)后的一個臨床標(biāo)志。