miR-92a在大鼠缺血再灌注心肌組織中的表達及對心肌細胞凋亡的影響

張黎靜 黃崢嶸 孫文超

(廈門大學附屬第一醫院心內科，福建 廈門 361000)

缺血再灌注(I/R)損傷是一種在心肌組織缺血后，重新恢復血流供應時，細胞代謝的功能障礙及結構損傷進一步惡化的現象，是臨床上在心臟手術后，引起心肌損傷的重要原因〔1〕。缺血性心臟病是臨床上常見的心肌I/R引起的心臟損傷。細胞凋亡是維持細胞穩態的重要過程，但其過度活躍則會導致I/R組織損傷〔2〕。微小RNA(miRNA)是基因表達的調節器，參與多種疾病的病理生理過程，而其在心血管疾病中的作用也備受關注和重視。miR-92a是miRNAs中的一員，在宮頸癌、白血病和肝癌等多種腫瘤疾病中表達上調，在腫瘤細胞增殖凋亡等生理過程中發揮重要調控作用〔3～5〕。研究發現，miR-92a在心血管疾病中發揮重要作用，抑制其表達可提高再內皮化和防止血管損傷后新生內膜形成〔6〕。本研究通過觀察miR-92a在I/R后大鼠模型心肌組織中的表達，探討其對心肌細胞凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 實驗用清潔級SD大鼠20只，鼠齡6～8 w，雄性，體重200～300 g，出生1～3 d的新生SD乳鼠10只，購于上海市實驗動物中心。

1.2試劑和儀器 miR-92a抑制劑(miR-92a inhibitor)和miR-92a 陰性對照(miR-92a NC)購于上海吉瑪制藥有限公司。DMEM培養液、胎牛血清、胰蛋白酶和Lipofectamine2000脂質體轉染試劑均購于美國Gibco公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，電化學發光(ECL)試劑盒、RNA提取試劑盒和RNA逆轉錄試劑盒購于大連Takara公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和膜聯蛋白-V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(FITC-Annexin V/PI)凋亡試劑盒購于南京凱基公司；淋巴瘤/白血病(Bcl)-2單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3多克隆抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠或抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗均購于美國Santa cruz公司。動物呼吸機購于浙江大學醫學儀器有限公司，CO2培養箱、紫外可見分光光度計購于美國Thermo公司，PCR儀、電泳儀和流式細胞儀購于美國Becton Dickinson公司。

1.3方法

1.3.1I/R損傷模型的制備 將SD大鼠以每組10只隨機分為I/R組和假手術組，所有大鼠經10%水合氯醛麻醉后，固定，行氣管插管，接通呼吸機機械通氣。對I/R組大鼠結扎冠狀動脈30 min后松開建立心肌缺血大鼠模型，在恢復供血后再灌注2 h。實驗過程中采用心電圖進行監測，在結扎后，出現心電圖ST段抬高、T波高聳等表現，而松開動脈夾開放供血后，出現抬高的ST段開始降低、T波慢慢恢復的現象，則表示I/R建模成功。

1.3.2心肌細胞培養及缺氧/復氧(H/R)模型建立 取新生SD乳鼠，以酒精消毒后，在無菌環境下處死取其心臟。以無菌眼科剪將其制成組織碎塊，加入胰蛋白酶于冰上預處理30 min后，攪拌器攪拌，取上清液；再向組織碎塊中加胰蛋白酶，預處理，攪拌，取上清液，重復3次后，將所有上清液合并離心。棄上清后加入DMEM培養液，重懸細胞后接種于培養皿中，于CO2培養箱中常規培養。待細胞貼壁生長時，取上清液，細胞計數后接種于6孔細胞板上，其中培養液為含有20%胎牛血清DMEM培養液。加入濃度0.1 mmol/L 5-溴脫氧核苷，培養72 h后，將細胞隨機分為常氧組和H/R組。其中，H/R組細胞經無血清處理12 h后，在1%O2-94%N2-5%CO237℃的培養箱中繼續培養24 h，取出培養板，再轉至95%空氣-5%CO2培養箱中培養2 h。常氧組細胞則一直在95%空氣-5%CO2培養箱中培養。

1.3.3miR-92a檢測 分別取新鮮的心肌組織和心肌細胞，加入Trizol提取細胞總RNA，采用紫外可見分光光度計測定所提到的總RNA的濃度及純度，以RNA反轉錄試劑盒將心肌組織或細胞的總RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，加入引物0.2 μl及相應組分制成10 μl的反應體系，按照95℃預變性180 s(1個循環)、95℃變性10 s(35個循環)、60℃退火20 s(35個循環)、72℃延伸10 s(35個循環)和72℃總延伸300 s(1個循環)的反應條件進行PCR擴增。以U6為內參基因，采用2-△△Ct法計算miR-92a在心肌組織和細胞中的相對表達水平。

1.3.4細胞轉染及分組 將制備的原代心肌細胞，調整細胞密度為6×106個/ml后接種于96孔細胞板上，置于CO2培養箱中常規培養24 h。將其隨機分為對照組，miR-92a NC組和miR-92a inhibitor組。以Lipofectamine2000將miR-92a 抑制劑和miR-92a 陰性對照分別轉染至miR-92a inhibitor組和miR-92a NC組細胞中，空白對照組細胞不做轉染，其中miR-92a 抑制劑和miR-92a 陰性對照的濃度為20 nmol/L。轉染6 h后，更換培養液后繼續培養48 h。以1.3.3中的實驗方法檢測其轉染效果。

將制備的原代心肌細胞，調整細胞密度后接種于96孔細胞板上，置于CO2培養箱中常規培養。將其隨機分為對照組、I/R組和I/R+miR-92a inhibitor組。將I/R組和miR-92a inhibitor+I/R組細胞在經無血清處理12 h后，在條件為1%O2-94%N2-5%CO237℃的培養箱中繼續陪養24 h，取出培養板，轉至95%空氣-5%CO2培養箱中繼續培養。其中miR-92a inhibitor+I/R組細胞繼續培養2 h后，以Lipofectamine2000將miR-92a抑制劑轉染至細胞中，轉染4 h后更換培養液繼續培養48 h。

1.3.5細胞凋亡實驗 收集上述對照組、I/R組和I/R+miR-92a inhibitor組細胞，以胰蛋白酶消化后，加入結合緩沖液重懸細胞。向含有105個細胞的100 μl細胞懸液中加入Annexin V-FITC 5 μl染色10 min后，再加入PI 10 μl染色，補加結合緩沖液500 μl，上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

1.3.6凋亡相關蛋白的檢測 收集對照組、I/R組和I/R+miR-92a inhibitor組細胞，以RIPA裂解液裂解各組細胞，提取細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測提取各組總蛋白的濃度。將蛋白置于沸水浴中變性后，取50 μg蛋白樣品，于5%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中進行分離。電轉印到聚偏二氟乙烯膜上，經封閉液4 ℃下封閉3 h后，加入Bcl-2(1∶1 000)、酶切Caspase-3(1∶1 000稀釋的)和GAPDH(1∶1 000)抗體，于4 ℃過夜，再以二抗(1∶2 000)室溫反應2 h，ECL試劑盒發光顯影，自動凝膠成像系統采集圖像。以GAPDH作為內參，分析Bcl-2和酶切Caspase-3蛋白的相對表達水平。

1.4統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1miR-92a在缺血再灌注心肌組織中的表達 與假手術組(1.02±0.03)相比，I/R組心肌組織中miR-92a的相對表達水平(2.35±0.16)顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2miR-92a在缺血再灌注后心肌細胞中表達及轉染效果 H/R組心肌細胞中miR-92a的相對表達水平(3.12±0.25)較常氧組(0.96±0.08)顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。RT-PCR檢測轉染48 h后對照組、miR-92a NC組和miR-92a inhibitor組心肌細胞中miR-92a的相對表達水平分別為(1.10±0.05)、(0.96±0.06)和(0.23±0.06)。與對照組相比，miR-92a NC組細胞中miR-92a的相對表達差異無統計學意義(P>0.05)，miR-92a inhibitor組細胞中miR-92a的相對表達量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3miR-92a對心肌細胞凋亡的影響 與對照組(6.38±0.52)%相比，I/R組細胞凋亡率(21.35±1.06)%顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；I/R+miR-92a inhibitor組細胞凋亡率(15.28±2.15)%較I/R組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4miR-92a對Bcl-2和酶切Caspase-3蛋白表達的影響 與對照組相比，I/R組細胞中Bcl-2蛋白的相對表達量顯著降低，酶切Caspase-3蛋白的相對表達量顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+miR-92a inhibitor組細胞中Bcl-2蛋白的相對表達量顯著升高，酶切Caspase-3蛋白的相對表達量顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測

組別Bcl-2酶切Caspase-3對照組0.92±0.050.14±0.03I/R組0.25±0.031)0.55±0.081)I/R+miR-92a inhibitor組0.68±0.062)0.23±0.042)F/P值148.157/0.00046.955/0.000

與對照組相比：1)P<0.05；與I/R組相比：2)P<0.05

3 討 論

MiR-92a基因家族是癌基因miR-17-92基因簇中的重要成員，它包括結構相似、序列相似和種子區序列相同的miR-25、 miR-363、miR-92a～1和miR-92a～2 的4個成員，是一類高度保守的與血管內皮細胞形成密切相關的miRNA；成熟的MiR-92a基因是由miR-92a～1和miR-92a～2基因生成〔9，10〕。研究發現，miR-92a在胃癌和結直腸癌等組織中呈現高表達，與淋巴結轉移和預后密切相關〔11，12〕。miR-92a還參與多種疾病細胞增殖凋亡的生理病理過程。Iaconetti等〔13〕通過體外實驗發現抑制miR-92a表達能夠促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移。Niu等〔14〕發現，miR-92a反義寡核苷酸通過逆表達BCL2L11誘導人腦膠質瘤細胞凋亡。Murata等〔15〕研究指出，通過抑制miR-92a能夠促進血管再生增強骨折愈合能力，在組織修復方面具有重要作用。本研究結果提示，下調miR-92表達可抑制I/R引起的細胞凋亡，進而起到減輕心肌缺血再灌注損傷的作用。

細胞凋亡是機體維護內環境穩態的程序性死亡過程，心肌細胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷程度密切相關，抑制心肌細胞凋亡是改善心肌缺血再灌注損傷的有效途徑。細胞凋亡是十分復雜而又嚴密的過程，受到多種基因和蛋白的多途徑調控。Bcl-2是公認的抗細胞凋亡基因，是細胞凋亡線粒體途徑的重要調控因子；Caspase-3是公認的細胞凋亡過程的執行者，在細胞凋亡過程中發揮著重要的核心調控作用〔16，17〕。Bcl-2和Caspase-3均是反應細胞凋亡的重要指標，缺血-再灌注后使心肌細胞受到刺激產生大量的自由基，引起細胞膜和線粒體等損傷，通過不同途徑激活或調控Caspase-3和Bcl-2基因，誘發細胞凋亡，與心肌細胞的凋亡過程密切相關。姚紅玲等〔18〕研究發現，心肌缺血/再灌注組大鼠肺組織中Caspase-3表達顯著升高和Bcl-2表達顯著減少。牛巍巍等〔19〕發現，miR-92a可能通過調控Bcl-2來抑制細胞凋亡。Lan等〔20〕研究指出，過表達miR-92a能夠通過MKK4-JNK1途徑和酶切Caspase-3蛋白的表達抑制H2O2誘導血管平滑肌細胞凋亡。本研究結果提示，miR-92a可能通過上調Bcl-2蛋白和下調酶切Caspase-3蛋白的表達，發揮了抗心肌細胞凋亡的作用。

綜上，miR-92a在缺血再灌注后心肌組織和細胞中呈現高表達，下調miR-92a表達后能夠減弱缺血再灌注引起的細胞凋亡，其作用機制可能與調控Bcl-2和酶切Caspase-3蛋白的表達有關。以miR-92a為靶點預防和減輕缺血/再灌注損傷等心血管疾病的研究提供新的方向和參考依據。