表面活性劑輔助酶解法提取辣椒中有效成分的工藝研究

張曉旭，周錫欽，嚴江，劉紅芹*，徐寶財

(1.北京工商大學 食品學院 北京市食品風味化學重點實驗室食品添加劑與配料北京工程研究中心，北京 100048；2.北京味食源食品科技有限責任公司，北京 101200)

辣椒提取物辣椒堿、辣椒二氫堿和辣椒紅色素等不僅可以作為食品添加劑，還可以應用到醫藥和軍事等領域[1-3]。我國目前對辣椒堿和辣椒二氫堿等有效成分的提取還處于初級階段，由于生產規模小，工藝設備落后，導致辣椒在我國的深加工及市場應用方面一直比較低迷。目前，酶法提取已廣泛應用于植物活性成分的提取，如酶法提取脂肪酸和黃酮等[4-6]。

然而，由于酶促反應涉及的步驟增加及后處理導致的成本增加，使得酶促反應的工業應用受到一定限制。研究表明，酶促反應中添加表面活性劑，不僅可以提高酶的水解速率，還可以降低酶的負載[7-9]。目前，表面活性劑輔助酶解技術很少涉及食品工業。本文利用酶和表面活性劑輔助提取辣椒中的辣椒堿、辣椒二氫堿、辣椒紅色素，通過單因素試驗和正交試驗優化其提取工藝，考察酶和表面活性劑添加量、酶解溫度和酶解時間等對其提取率的影響規律，為辣椒的精加工和綜合利用提供一定的科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣椒 北京味食源食品有限公司；辣椒堿、辣椒二氫堿、辣椒紅色素標準物質(≥98%) Dr.Ehrenstorfer GmbH；纖維素酶(酶活力50000 U/g) 河南亞通食品原料有限公司；乙醇(分析純)、甲醇(色譜純) 北京化工廠；食品級硬脂酰乳酸鈣(CSL)、硬脂酰乳酸鈉(SSL)、吐溫-80和司潘-60 濟南蘭欣生物技術有限公司。

1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；UV Vis Spectrophotometer(UV-3600) 北京瑞麗分析儀器有限公司；高速萬能破碎機(DGF-100) 黃陂解放儀器廠；電子天平(FA1004N) 上海精密科學儀器有限公司；電加熱水浴鍋(DY-H) 上海圣奇儀器有限公司；高速離心機(TG16) 長沙英泰儀器有限公司；KQ-250D 超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒堿和辣椒二氫堿的提取

辣椒去籽，粉碎，稱取5.0 g，加入40 mL蒸餾水和0.3%(W/W)的纖維素酶，50 ℃反應2 h后進行離心分離，取上清液，殘渣用甲醇與四氫呋喃的混合溶液(1∶1，V/V)進行超聲提取，溫度60 ℃，功率70 W，提取時間1 h，過濾，得到包含辣椒堿和辣椒二氫堿的濾液。

1.2.2 辣椒紅色素的提取

辣椒去籽，粉碎過篩，稱取 5.0 g，加入40 mL蒸餾水和0.2% (W/W)的纖維素酶，50 ℃反應2 h后進行離心分離，取上清液，殘渣用40 mL丙酮浸提劑，超聲提取30 min，過濾，得到包含辣椒紅色素的濾液。

1.2.3 繪制辣椒堿標準曲線

圖1 辣椒堿(A)、辣椒二氫堿(B)和辣椒紅色素(C)的標準曲線

用甲醇和四氫呋喃的混合溶液1∶1(V/V)配制濃度分別為0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 mg/mL的辣椒堿標品溶液，進行高效液相色譜(HPLC)測定，以樣品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線(見圖1中A)：辣椒堿在0.01～0.5 mg/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為y=4270.6x-10.564，r2=0.9999。

1.2.4 繪制辣椒二氫堿標準曲線

用甲醇和四氫呋喃的混合溶液1∶1(V/V)配制濃度分別為0.004，0.021，0.034，0.052，0.170 mg/mL的辣椒二氫堿標品溶液，進行HPLC測定，以標品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線(見圖1中B)：辣椒二氫堿在0.0042～0.170 mg/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為y=3363.8x+4.2657，r2=0.9996。

1.2.5 繪制辣椒紅色素標準曲線

用丙酮配制濃度分別為0.38，0.33，0.29，0.23，0.046，0.033 mg/mL的辣椒紅色素標品溶液，以丙酮作參比，于波長460 nm 處測吸光度，以標品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線(見圖1中C)：辣椒紅色素在0.033～0.38 mg/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為y=5.5226x-0.0112，r2=0.9999。

1.3 測定方法

1.3.1 辣椒堿和辣椒二氫堿的測定

以HPLC法測定其含量，色譜條件：色譜柱為反相C18柱(15 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為甲醇∶水為80∶20(V/V)，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為760 nm，進樣體積為10 μL。辣椒堿、辣椒二氫堿的含量采用面積外標法計算。

1.3.2 辣椒紅色素的測定

利用紫外可見分光光度計在460 nm處測量辣椒素含量。辣椒紅色素的含量采用面積外標法計算。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

通過單因素試驗，分析纖維素酶添加量、料液比、酶解時間、酶解溫度、辣椒粒度、表面活性劑類型和表面活性劑添加量這7個因素對提取辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響。

2.1.1 酶添加量對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

固定酶解時間為2 h，酶解溫度為50 ℃，料液比為1∶8 (g/mL)，試驗考察了纖維素酶添加量對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響，試驗結果見圖2。

圖2 添加酶與空白組對比(A)、酶添加量(B)、料液比(C)和酶解時間(D)對辣椒堿、辣椒二氫堿和辣椒紅色素含量的影響

由圖2中A可知，添加酶的試驗組中，辣椒堿、辣椒二氫堿和辣椒紅色素的含量均較空白組高。且由圖2中B可知，3種物質的含量隨酶添加量的增大而增大，在酶添加量為0.3%(W/W)時，辣椒堿、辣椒二氫堿的含量達到最大值。在酶添加量為0.2%(W/W)時，辣椒紅色素的含量達到最大。分析原因可能是，當酶添加量較低時，底物過量，酶解不完全，致使辣椒中的有效成分溶出率不高，隨著酶添加量的增加，酶解作用增加，辣椒中關鍵物質的溶出率也隨著增加，而當酶添加過量時，由于酶與底物的結合飽和，3種物質的含量不會繼續增長。

2.1.2 料液比對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

分別固定纖維素酶添加量為0.3%(辣椒堿、辣椒二氫堿的提取試驗)和0.2%(辣椒紅色素的提取試驗)，其他條件保持不變，試驗考察了料液比對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響，試驗結果見圖2中C。

由圖2中C可知，隨著料液比的增加，辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的含量先增加后降低。當料液比較低時，反應體系的粘度降低，有利于底物的水解，使辣椒細胞中有效物質的擴散增加，反應更加充分。隨著料液比的進一步增加，酶的濃度大大降低，不利于酶與底物的緊密接觸，從而降低了底物的水解率，關鍵物質的提取率也隨之降低。因此，提取辣椒堿和辣椒二氫堿的最佳料液比為1∶8(g/mL)，提取辣椒紅色素的最佳料液比為1∶7(g/mL)。

2.1.3 酶解時間對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

在最適酶添加量和料液比的試驗條件下，其他條件不變，試驗考察了酶解時間對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響，試驗結果見圖2中D。

由圖2中D可知，隨著酶解時間的增加，辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的含量先增加后降低。原因可能是，隨著時間的增加，酶解反應充分，有利于辣椒細胞中關鍵物質的溶出，而當酶解時間過長時，辣椒中的辣椒堿和辣椒二氫堿等有效物質會有一部分分解，導致其含量降低。綜合比較，提取辣椒堿和辣椒二氫堿的最適酶解時間為3 h，提取辣椒紅色素的最適酶解時間為2 h。

2.1.4 酶解溫度對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

圖3 酶解溫度(A)和辣椒粒度(B)對辣椒堿、辣椒二氫堿和辣椒紅色素含量的影響

在酶解時間、酶添加量和料液比均為上述試驗中的最佳條件下，試驗考察了酶解溫度對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響，試驗結果見圖3中A。

由圖3中A可知，隨著酶解時間的增加，辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的含量先增加后降低。原因可能是，溫度與酶解時間有關，酶解時間短，失活不明顯，最佳溫度較高；反應時間越長，最佳溫度越低。由于這種關系，酶的最適溫度只有在一定條件下才有意義，同時由于溫度過高，會導致部分酶失活。因此，確定提取辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的最適酶解溫度均為50 ℃。

2.1.5 辣椒粒度對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

固定酶解溫度、酶添加量、酶解時間和料液比均為上述試驗的最佳條件下，試驗考察了辣椒粒度對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響，試驗結果見圖3中B。

由3中B可知，3種物質的含量均隨著粒度的增加呈現先增加后減小的趨勢，其原因可能是材料破碎后，顆粒尺寸變小，表面能增加，細胞內物質浸出速度增加。但是，隨著物料粒度的進一步減小，樣品粉末的表面積過大，吸附效果增強，不利于細胞中物質的浸出。綜合分析，確定提取辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的最佳粒度為100目。

2.1.6 表面活性劑對辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

圖4 表面活性劑種類(A)和SSL添加量(B)對辣椒堿、辣椒二氫堿和辣椒紅色素含量的影響

試驗表明，在酶反應過程中加入表面活性劑可以提高酶解效率。表面活性劑的存在可以通過減少“更多的剩余表面”來減少溶液的表面張力，且可以防止纖維素酶與空氣表面接觸并穩定纖維素酶的活性[10]。此外，在膠束體系中，疏水性底物將被隔離在表面活性劑分子的聚集體內，并且可用于酶催化水解反應的有效底物濃度將不等于總底物濃度，可與酶相互作用的底物濃度也將取決于表面活性劑的性質、底物與表面活性劑的比例以及其他反應條件，如pH和溫度。同時，由于膠束表面的吸附或解吸，活性表面活性劑的濃度也會因不同的表面活性劑而變化[11]。因此，本文考察了酶解反應中添加硬脂酰乳酸鈉(SSL)、硬脂酰乳酸鈣(CSL)、吐溫-80和司潘-60等表面活性劑對3種物質提取率的影響，每種表面活性劑的加入量約為0.5%(W/W)，研究結果見圖4中A。由圖4中A可知，添加SSL的時候，3種物質的提取含量均達到最大。因此，本試驗對SSL 的添加量做了進一步的優化試驗，試驗結果見圖4中B。由圖4中B可知，提取辣椒堿、辣椒二氫堿的SSL的最佳添加量為0.4%(W/W)，提取辣椒紅色素的SSL的最佳添加量為0.3%(W/W)。

2.2 正交試驗

為了更科學合理地確定提取辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的最優工藝，在單因素試驗的基礎上，繼續采用L18(36)正交表進行正交試驗，因素水平表和試驗結果分析表分別見表1和表2。

表1 提取辣椒堿和辣椒二氫堿的正交試驗的因素水平表

表2 提取辣椒堿和辣椒二氫堿的正交試驗的結果分析表

由表2可知，各因素對提取辣椒堿含量影響的主次順序為：酶解時間>酶解溫度>酶添加量>料液比>SSL的添加量>粒度；各因素對提取辣椒二氫堿含量影響的主次順序為：酶解時間>酶添加量>酶解溫度>粒度>料液比>SSL的添加量，而最優水平組合為A3B1C2D1E3F2，即纖維素酶添加量0.4%(W/W)、酶解時間4 h、酶解溫度45 ℃、料液比1∶8 (g/mL)、SSL的添加量1%(W/W)、辣椒粒度100目，此時，辣椒堿的含量可達7.82 mg/g，辣椒二氫堿的含量為4.94 mg/g。

表3 提取辣椒紅色素的正交試驗的因素水平表

表4 提取辣椒紅色素的正交試驗的結果分析表

由表3和表4可知，各因素對提取辣椒紅色素含量影響的主次順序為：粒度>酶解時間>SSL的添加量>料液比>酶解溫度>酶添加量，而其最優水平組合為A2B3C3D1E1F2，即酶添加量0.8 %(W/W)、酶解時間2 h、酶解溫度55 ℃、料液比1∶5(g/mL)、SSL的添加量0.6%(W/W)，辣椒粒度為粉碎后過100目篩，此時，辣椒紅色素的含量為31.25 mg/g。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗初步確定了表面活性劑輔助酶解法提取辣椒堿、辣椒二氫堿的最優條件為：纖維素酶添加量為0.4%(W/W)，酶解時間為4 h，酶解溫度為45 ℃，料液比為1∶8 (g/mL)，SSL的添加量為1%(W/W)，辣椒粒度為100目；提取辣椒紅色素的最優條件為：纖維素酶的添加量為0.8 %(W/W)，酶解時間為2 h，酶解溫度為55 ℃，料液比為1∶5 (g/mL)，SSL的添加量為0.6%(W/W)，辣椒粒度為粉碎后過100目。在此優化條件下，辣椒堿的含量可達7.82 mg/g，辣椒二氫堿的含量為4.94 mg/g，辣椒紅色素的含量為31.25 mg/g，相比不添加酶的空白處理，分別增加了3.53，2.82，20.01 mg/g，3種物質的含量都達到了較高水平，有用于實際生產的應用前景。同時研究還表明，表面活性劑輔助酶解提取法可以有效降低酶解工藝中的成本，在天然產物有效成分的提取中具有廣闊的應用前景。