泡菜中兼具耐酸性和亞硝酸鹽分解活性的乳酸菌株的篩選和鑒定

金成武，杜林曉，陳鑫，張悅，張斯程，劉文麗，孫舒揚

(魯東大學(xué) 食品工程學(xué)院，山東 煙臺 264025)

泡菜是我國傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的代表，它是以白菜、蘿卜等蔬菜為主要原料，經(jīng)過乳酸菌群協(xié)同發(fā)酵制成的一種發(fā)酵類食品[1,2]。泡菜口感清爽、味道鮮美，含有多種維生素及礦物質(zhì)，可促進人體內(nèi)腸胃蠕動、助消化，還具有降低人體內(nèi)膽固醇含量的作用。乳酸菌是泡菜生產(chǎn)過程中的優(yōu)勢菌，在泡菜的整個發(fā)酵過程中非常重要，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmensenteroides)和短乳桿菌(L.brevis)是其中最主要的乳酸菌種[3,4]。

傳統(tǒng)的泡菜制作方式都是采用自然發(fā)酵法，發(fā)酵周期較長，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，亞硝酸鹽含量也較高[5]。亞硝酸鹽的生成和積累極大地影響了泡菜的食用安全性，因為亞硝酸鹽在酸性條件下能與胺類及氨基酸等含氮化合物反應(yīng)，生成具有致癌作用的亞硝胺和亞硝酰胺[6，7]。亞硝酸鹽的生成主要在泡菜發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵時間的延長，亞硝酸鹽的含量也會逐漸降低。但是工業(yè)化生產(chǎn)為了提高生產(chǎn)效率，往往縮短發(fā)酵周期，亞硝酸鹽可能仍維持在較高的濃度。因此，篩選降解亞硝酸鹽能力強且生長速率快的乳酸菌菌株對泡菜的生產(chǎn)和推廣應(yīng)用十分重要。

本研究以市售泡菜為研究對象，從中篩選出乳酸菌，研究其基本生理生化特性、產(chǎn)酸性能、降解亞硝酸鹽的能力以及耐酸性，進而篩選出各方面性能都比較優(yōu)異的乳酸菌株，并對其采用API 50 CHL碳水化合物的發(fā)酵產(chǎn)酸試驗及分子生物學(xué)技術(shù)進行鑒定。本研究可以豐富乳酸菌菌種資源，并為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

購買市售泡菜11種，產(chǎn)地包括煙臺、青島、廣州、北京和成都。

1.2 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖20 g，酵母粉5 g，牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，蛋白胨5 g，吐溫80 1 g，檸檬酸三銨 2 g，磷酸二氫鉀2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸錳0.05 g；pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 試劑

胰蛋白胨、乙酸鈉、牛肉浸膏：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；引物、PCR Master Mix、細菌基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；革蘭氏染色液：南京建成科技有限公司；其他試劑：均為分析純。

1.4 儀器

生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XSP-BM-2CA生物顯微鏡 上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；PCR擴增儀 杭州博日科技有限公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；FE20K pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；Cary60紫外可見分光光度計 美國Agilent公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 泡菜樣品中乳酸菌的分離純化

向10 g泡菜中加入90 mL無菌水，充分振蕩，采用梯度稀釋進行稀釋，稀釋度為101～108。吸取0.2 mL稀釋液涂于含有0.5% CaCO3的改良MRS固體培養(yǎng)基上，30 ℃厭氧箱中培養(yǎng)2～5天，觀測菌落形成情況。選取有鈣圈生成的菌落，挑取單菌落，反復(fù)進行劃線分離直至獲得純菌落。

1.5.2 乳酸菌的初步確定及形態(tài)學(xué)觀察

挑取純化后的菌落進行革蘭氏染色和過氧化氫酶接觸試驗。革蘭氏染色呈現(xiàn)陽性且過氧化氫酶呈現(xiàn)陰性初步判斷為乳酸菌，通過革蘭氏染色鏡檢圖片記錄乳酸菌形態(tài)特征。

1.5.3 菌液pH 測定

乳酸菌菌株在改良MRS液體培養(yǎng)基中于30 ℃培養(yǎng)24 h，用pH計測定菌液pH值并記錄。

1.5.4 降解亞硝酸鹽能力測定

亞硝酸鹽含量采用國標(biāo)法(GB 5009.33-2010)測定。用改良的MRS液體活化保存的乳酸菌菌株，按0.2%接種量接入含亞硝酸鈉100 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于35 ℃培養(yǎng)60 h，每間隔12 h取樣，測定發(fā)酵液中的亞硝酸鹽含量。

1.5.5 耐酸性試驗

液體培養(yǎng)的菌株按1%的接種量接種到pH 2.0(HCl調(diào)節(jié))的酸性MRS培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，利用稀釋涂布法計數(shù)，計算菌株成活率，判斷菌株的耐酸性。

1.5.6 糖發(fā)酵試驗

根據(jù)API 50 CHL系統(tǒng)說明書進行操作，將測試菌株于30 ℃分別培養(yǎng)24 h和48 h，而后讀取產(chǎn)酸試驗結(jié)果并進行記錄，將結(jié)果輸入API plus軟件，初步判定菌種的種屬。

1.5.7 乳酸菌16S rDNA基因序列測定

將篩選的乳酸菌菌株的基因組DNA進行PCR擴增，用1%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測。使用細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3')擴增，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測定的序列通過BLAST在GenBank中進行同源性比較，并將其鑒定到種。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離和篩選

各種泡菜中所分離出的乳酸菌株數(shù)見表1。從北京、煙臺等4個產(chǎn)地生產(chǎn)的白菜、蘿卜、蘇子葉、豇豆4類泡菜中共分離出45株類似乳酸菌的細菌，其中，煙臺地區(qū)市售散裝泡菜中獲得13株，青島市售泡菜中得到13株，北京地區(qū)泡菜中分離出5株，成都地區(qū)商品化泡菜中獲得14株。

表1 各種泡菜中所分離出的乳酸菌株數(shù)Table 1 The LAB strains isolated from different pickles

續(xù) 表

通過革蘭氏染色后鏡檢觀察菌體形態(tài)，結(jié)果顯示：其中36菌株為革蘭氏陽性，不移動，無芽孢生成。其中，33.3%細胞呈橢圓形或圓形，單個、成對或者成串排布；66.7%為桿菌，桿菌排列方式多樣，呈單桿、雙桿或多桿并存的形態(tài)。再將這36株菌進行過氧化氫酶測試，發(fā)現(xiàn)所有菌株均無氣泡產(chǎn)生，即為陰性，因此，初步推斷該36株菌為乳酸菌。并將該36株菌按照其泡菜編號及發(fā)現(xiàn)順序依次命名。

泡菜中乳酸菌的種類與所用的蔬菜原料、腌制方法及腌制時間有關(guān)。商軍等從泡蘿卜、泡辣椒和泡白菜中分離出11個乳酸菌株，并對各菌株進行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)不同泡菜中的乳酸菌菌株有明顯差異，泡蘿卜中以短乳桿菌為主，泡辣椒中以短乳桿菌和片球菌為主，泡白菜中以短乳桿菌和鏈球菌為主[8]。據(jù)報道，在泡菜發(fā)酵前期，腸膜明串珠菌和鏈球菌是優(yōu)勢乳酸菌，這些菌株積累有機酸并形成厭氧環(huán)境。進入發(fā)酵中后期，植物乳桿菌和短乳桿菌逐漸成為優(yōu)勢菌群，它們能夠耐受酸性環(huán)境，且不產(chǎn)氣[9]。對于本課題而言，市售的各種泡菜原料可能都處于發(fā)酵中后期，因此分離出的乳酸菌株以桿菌居多。

2.2 乳酸菌發(fā)酵液的pH

將泡菜中分離出的36株乳酸菌在改良的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，跟蹤測定發(fā)酵液的pH變化，試驗結(jié)果見表2。有13株菌的菌液pH在3.5～4.0之間，有16株菌的菌液pH處于4.0～4.5之間。其中菌株Q12的菌液pH值最低，為3.79。總體而言，所測菌液的pH都處在3.5～5.0之間，平均值為3.94，從而證明這36株乳酸菌的產(chǎn)酸性能均較好。

表2 乳酸菌發(fā)酵液pH分組統(tǒng)計Table 2 pH values of broth resulting from different LAB strains

2.3 降解亞硝酸鹽的菌株的篩選

泡菜制作過程中一般會伴隨亞硝酸鹽含量的逐步增加，給泡菜帶來了安全隱患。乳酸菌能夠降解亞硝酸鹽是由于其含有亞硝酸鹽還原酶，該酶能夠作用于亞硝酸鹽使之分解產(chǎn)生氨[10,11]。將36株乳酸菌株按1%(V/V)接種量接入含125 mg/L的亞硝酸鹽培養(yǎng)液中，30 ℃培養(yǎng)，間隔12 h取樣，測定培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽含量，計算菌株對亞硝酸鈉的降解率。

檢測結(jié)果表明，空白組的亞硝酸鹽含量最高，亞硝酸鹽降解率僅為22.5%，說明未接種乳酸菌的試驗組的降解能力較弱。接種乳酸菌菌株的培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽含量均有一定程度的下降，降解率在59.1%～99.8%。不同乳酸菌降解亞硝酸鹽的能力差別較大，其中活性最強的是Y1、Y4、Q6和Q12，接種這4株乳酸菌的培養(yǎng)液的亞硝酸鹽的降解率分別達到98.7%，99.1%，97.9%，99.8%。這4株乳酸菌的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)見表3，亞硝酸鹽降解過程見圖1。

表3 具有高效亞硝酸鹽降解能力的乳酸菌菌落形態(tài)和菌體形態(tài)Table 3 The colonial and cellular morphology of LAB strains capable of nitrite degradation

圖1 4株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中降解亞硝酸鹽的進程Fig.1 The nitrite degradation in the MRS medium inoculated with 4 LAB strains

2.4 耐酸性菌株的篩選

乳酸菌進入人體后需要耐受人體的腸道環(huán)境才能存活并發(fā)揮其益生作用，因此，對于具有乳酸菌而言，不可避免地需要經(jīng)受胃部消化液——胃酸的考驗，因此乳酸菌菌株的耐酸性對于其自身而言非常重要。為考察所篩選菌株的耐酸性，本研究將分離獲得的4株乳酸菌進行耐酸性試驗。在無菌條件下，用接種針挑取分離菌株的菌落于澄清的pH 2.0的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。檢測結(jié)果表明，4株乳酸菌各自具有一定的耐酸性，但仍存在較大差異。Y1、Y4、Q6和Q12的成活率分別是21.5%，19.1%，26.5%，44.2%。Q12菌株耐酸性最強，具有應(yīng)用的潛力。

2.5 糖發(fā)酵試驗

將篩選到的耐酸性較強的Q12進行糖發(fā)酵產(chǎn)酸試驗。根據(jù)API 50 CHL系統(tǒng)說明書進行操作，將Q12在49 種碳水化合物中分別培養(yǎng)24 h和48 h，觀察記錄其產(chǎn)酸結(jié)果(見表4)，并利用API plus軟件對結(jié)果進行鑒定。試驗結(jié)果表明，菌株Q12與植物乳桿菌(66%)和戊糖乳桿菌(34%)的同源性較高。

表4 菌株的API 50 CHL反應(yīng)結(jié)果Table 4 Results of API 50 CHL test reaction

續(xù) 表

2.6 16S rDNA序列測定

對菌株Q12的16S rDNA基因進行PCR擴增，獲得了基因片段(1479 bp)，見圖2。所得擴增產(chǎn)物純化后測序，輸入GenBank中進行同源性比對，結(jié)果顯示菌株16S rDNA基因片段與植物乳桿菌同源性均達到99.9%以上，由此可判定菌株Q12為植物乳桿菌(L.plantarum)。

圖2 PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplified electrophoresis

3 結(jié)論

乳酸菌是泡菜中的主要微生物，利用其降解亞硝酸鹽的能力可以提高泡菜的食用安全性。本課題從11種市售泡菜中分離獲得了多株乳酸菌，通過革蘭氏染色、過氧化氫酶活性測定，確定其中36株為乳酸菌。對這36株乳酸菌的產(chǎn)酸能力、亞硝酸鹽降解能力和耐酸性進行測試，最終獲得了1株既具有良好耐酸性又具有高效亞硝酸鹽降解活性的菌株。該菌株對亞硝酸鹽的降解率可以達到99.8%，在pH 2.0的MRS培養(yǎng)基中仍可維持44.2%的成活率。隨后對該菌株進行生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為植物乳桿菌(L.plantarum)。本研究豐富了乳酸菌菌種資源，并為進一步研究泡菜乳酸菌的功能性及機理以及菌株在泡菜中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。