川西藏區牦牛酸醡肉中產蛋白酶和淀粉酶菌株的分離鑒定及其生理特性分析

何江紅，王榮鈺，2，舒小芳，趙潔，盧雪松*

(1.四川旅游學院，成都 610100；2.四川理工學院，四川 自貢 643000)

酸肉是我國西南少數民族地區傳統的發酵肉制品，以豬肉、魚肉為原料，輔以玉米粉、米粉或青稞粉及多種調味料在自然條件下經厭氧發酵而成，品種主要分為三大類：湖南湘西地區侗族傳統酸肉、貴州荔波傳統酸肉、川西藏區臭肉[1-3]。國內外有關酸肉的報道主要針對發酵肉的生產工藝、發酵條件、發酵風味形成及風味變化[4-6]。李華麗等人研究了鹽濃度、葡萄糖濃度、發酵時間和發酵溫度對酸肉pH值的影響，確定了酸肉在自然發酵下的最佳發酵條件，說明了發酵肉制品的優越性[7，8]。竺尚武等人對金華火腿中的揮發性風味物質進行了研究，得出經過長期的腌制和成熟過程,肌肉蛋白和脂肪在蛋白酶和脂肪酶的作用下,產生大量更易于消化吸收的多肽、游離氨基酸、游離脂肪酸等物質,并形成大量的揮發性化合物,賦予腌制肉品獨特的香氣[9-11]。

傳統酸肉是采用多菌種混合自然發酵，菌種主要來源于原材料以及自然環境。由于自然狀態下，微生物的種類與生理特性因環境條件的影響極大，因此傳統發酵技術難以控制酸肉的食用品質與安全問題，阻礙了酸肉的工業化、規模化生產。目前已有學者對酸肉制品的優勢菌種進行篩選及鑒定[12-16]，李宗軍等人還發現酸醡肉的優勢菌群主要為乳酸菌、微球菌及酵母菌。周才瓊等對渝黔苗漢雜居地區傳統酸肉有關微生物區系和營養特性進行了研究，研究表明發酵可以提高酸肉蛋白質營養價值。陳曦、周彤等人從貴州酸肉中篩選出具有高亞硝酸鹽降解和耐受能力的乳酸菌。杜斌、李苗苗等人從貴州傳統酸肉、腌魚中篩選鑒定出可降解膽固醇的乳酸菌，為傳統酸肉制品的保健功能作用提供了研究基礎。眾多研究表明，微生物的種類與特性是酸肉發酵過程中的關鍵因素之一，其為酸肉提供了良好的風味，改變了肉質的組織性狀，有效抑制了有害物質產生，且縮短了發酵周期。

牦牛是高寒地區的特有牛種，屬于草食性反芻家畜，半野生放牧的飼養方式，牦牛肉富含蛋白質和氨基酸以及胡蘿卜素、磷、鈣等微量元素，但因其飼養周期長，肉膻味重，肉質粗老，口感堅韌，硬度較大，對產品加工產生了極大的阻礙與限制[17，18]。從川西藏區扎壩臭豬肉加工中獲取靈感，并借鑒川渝地區傳統酸醡肉的發酵工藝，研發了牦牛酸醡肉，并研究了該產品在不同烹飪方式下的食用品質[19]。現階段牦牛酸醡肉加工技術尚屬于自然發酵。在牦牛酸醡肉發酵過程中，微生物所產生的蛋白酶和淀粉酶作用于牦牛肉和青稞粉，改善牦牛肉粗老的肉質，同時又能賦予產品以特殊風味[20，21]。但對于川西藏區牦牛酸醡肉自然發酵過程中微生物特性研究的相關報道尚屬空白。本實驗從牦牛酸醡肉中分離產蛋白酶和產淀粉酶的菌株，對其進行產酶活性和生理特性研究，經基因測序，確定目標菌。后期可將目標菌應用到牦牛酸醡肉發酵劑研發中。以期為后續牦牛酸醡肉實現工業化、規模化、規范化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牦牛肉：符合GB 18393—2001《牛羊屠宰產品品質檢驗規程》，實驗當天購自四川省甘孜州白玉縣綜合農貿市場。實驗室自制40目炒青稞全粉，由甘孜州農科所八美農場提供的康青8號(2016，2017年產)。小西瓜白砂糖：北京廚大媽食品集團有限公司；綠色生態鹽：四川久大制鹽有限公司；窩窩醪糟：成都巨龍生物科技有限公司；干辣椒、辣椒粉、花椒粉、生姜、大蔥、蒜、八角粉：購于成都市龍泉驛區平安菜市。

培養基配方藥品 北京奧博星生物科技有限公司；可溶性淀粉 成都市科隆化工試劑廠；蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸石碳酸棉藍染液、酪蛋白、酪氨酸、結晶紫 天津市致遠化學試劑有限公司；過氧化氫、95%乙醇 國藥集團化學試劑有限公司。所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SHP0201147047型電子分析天平 上海恒平科學儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LRH-250型生化培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；QYC-2102C型搖床 上海福瑪實驗設備有限公司；DHG-9140型電熱恒溫干燥箱 上海三發科技儀器有限公司；YX-280立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司；BH200微生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；722S型分光光度計 無錫天牧儀器科技有限公司；HHS-8S型恒溫水浴鍋 上海光地儀器有限公司。

1.3 方法[22-28]

1.3.1 樣品制備

根據國家發明專利201610348936.2所提供的加工方法進行制作：(1)將曬干后干凈的青稞翻炒并進行打粉，獲得炒青稞粉；(2)將牦牛肉洗凈剔除筋腱，切塊備用；(3)按比例將炒青稞粉、辣椒粉、花椒粉、香辛料、酒釀、姜末、白糖和食鹽混合，均勻涂抹在牦牛肉上，于密閉容器中發酵。

1.3.2 菌株分離

參照GB 4789.2—2016提供的方法對發酵過程中的牦牛酸醡肉進行取樣制樣，利用選擇培養基篩選出芽孢桿菌、乳酸菌、真菌。

1.3.3 產酶菌株篩選

1.3.3.1 產蛋白酶菌株篩選

將分離純化后的菌株接種到對應產蛋白酶篩選培養基中，36 ℃培養48 h后觀察菌株周圍是否有蛋白酶水解圈，若有，即判定該菌株具有產蛋白酶活性。

1.3.3.2 產淀粉酶菌株篩選

將分離純化后的菌株接種到對應淀粉培養基平板上，36 ℃培養48 h后將碘液滴加菌落上，有透明水解圈的菌落即判定該菌有產淀粉酶活力。

1.3.4 產酶活性測定

1.3.4.1 產蛋白酶活力

參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》提供的方法測定。

1.3.4.2 產淀粉酶活力

參照提供的淀粉酶活力測定方法測定。

1.3.5 形態學鑒定

1.3.5.1 菌落形態觀察

按無菌操作將各個菌株接種于對應的固體培養基，36 ℃培養48 h，觀察菌落大小、形態、顏色、光澤度、透明度等，做好記錄。

1.3.5.2 個體形態觀察

按微生物指導書中革蘭氏染色法對各菌株染色，辨別其為陽性菌或是陰性菌[29]，并在100倍油鏡下觀察其菌體形態、大小、有無芽孢及其著生位置等，毛霉菌采用乳酸石碳酸棉藍染色。嚴謹觀察、描述、拍照、記錄。

1.3.6 生理特性研究

產過氧化氫酶活性；糖類發酵實驗；乳酸菌產酸能力測定。

1.3.7 菌株基因序列測定

以活化后的目的菌株菌落為模板，細菌按照DP302試劑盒提取DNA，進行PCR擴增16S rDNA片段，引物為細菌16S rDNA通用引物，引物序列如下：

27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

真菌按照DP336試劑盒提取DNA，進行PCR擴增ITS片段，引物為真菌ITS通用引物，引物序列如下：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

PCR體系為25 μL：27F和1492R各1 μL，PremixTaq酶12.5 μL，DNA模板適量，滅菌雙蒸水補足體系25 μL。

PCR反應程序：預變性95 ℃ 8 min，變性95 ℃ 45 s，復性55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 2 min，25個循環，補充延伸72 ℃ 10 min，保存于12 ℃ 5～10 min。

PCR產物經核酸電泳檢測后,送至成都擎科梓熙生物技術有限公司測序，將所測定菌株的序列同GenBank中已提交的序列進行B1astN分析和同源比對，確定菌株種屬，再利用MEGA 5.05構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

選擇培養基，從牦牛酸醡肉中共分離純化得到乳酸菌11株、芽孢桿菌10株、真菌17株(不排除同種菌)，一一編號，保存于4 ℃冰箱備用。

2.2 產酶菌株的篩選

經產蛋白酶活性篩選，共有7株菌有產蛋白酶能力，其中有2株乳酸菌，2株真菌，3株芽孢桿菌，分別編號為R1，R2，Z1，Z2，Y1，Y2，Y3；經產淀粉酶活性篩選，共有3株菌有產淀粉酶能力，且均為具有產蛋白酶能力的芽孢桿菌，即為Y1，Y2，Y3，詳細結果見表1。

表1 產蛋白酶能力Table 1 Protease producing ability

2.3 產酶活性分析

2.3.1 產蛋白酶活性

表2 菌株產蛋白酶活力Table 2 The protease-producing abilities of the strains

注：數據中標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖1 各菌株產蛋白酶活力對比Fig.1 Comparison of protease production capacity of each strain

由表2和圖1可知，各種菌產蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)，其中芽孢桿菌Y1，Y2，Y3產蛋白酶活力最佳，其次是乳酸菌R1和R2，Z1產蛋白酶活力最差。

2.3.2 產淀粉酶活性

三株芽孢桿菌產淀粉酶活力差異顯著(P<0.05)，其中Y1最強，其次是Y2，Y3產酶活力較弱，見表3和圖2。

表3 菌株產淀粉酶活性Table 3 The ability of the strain to produce amylase

注：數據中標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 各菌株產淀粉酶活力對比Fig.2 Comparison of amylase production capacity of each strain

2.4 形態學鑒定

對分離出的7株產蛋白酶菌株的菌落形態進行觀察鑒定。通過革蘭氏染色和霉菌的乳酸石碳酸棉藍染色，觀察菌株的個體形態，并確定有6株菌為革蘭氏陽性菌，觀察結果見表4。

表4 形態描述Table 4 Morphological description

2.5 生理特性分析

生理生化特征分析結果見表5，參照伯杰細菌鑒定手冊，菌株R1，R2，Y1，Y2，Y3，Z1，Z2的生理特性和植物乳桿菌、戊糖片球菌、淀粉液化芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌亞種、鐮刀霉、黑曲霉的基本特征相吻合。根據結果可知7株菌株都具有良好的分解糖類的能力，其中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖所有菌株均能分解，具有糖酵解能力是發酵菌所必須需能力。此外，2株乳酸菌也具有良好的分解乳糖的能力，它們不僅能利用來自青稞的糖分，同時也能利用來自牦牛肉的糖分進行發酵，屬于優質發酵菌。

表5 生理特性分析Table 5 Physiological analysis

對2株乳酸菌產酸能力的測定結果見表6，R1和R2均具有較好的產酸能力，能有效地降低發酵體系的pH，從而產生酸醡肉特有的酸味，并且其產生的酸性環境能有效地抑制其他雜菌的侵染，防止發酵過程發生腐敗。對比2株乳酸菌的產酸能力可知，R1產酸能力優于R2，因此在實際發酵劑的配制過程中，可根據目標產品的風味要求調整2種菌株的使用配比。

表6 乳酸菌產酸能力Table 6 The acid-producing ability of lactic acid bacteria

2.6 基因序列測定

根據1.3.7的方法步驟，處理篩選到的2株乳酸菌、3株芽孢桿菌和2株真菌，得到相應菌株的16S rDNA序列和ITS序列，將各個菌株序列在CNBI基因庫中進行同源性比較，獲得和各菌株序列相似度最高的菌株，即認定該菌株種類，具體結果見表7，發育樹見圖3和圖4。

表7 基因測序結果Table 7 Gene sequencing results

圖3 細菌發育樹Fig.3 Bacterial growth tree

圖4 真菌發育樹Fig.4 Mycogenetic growth tree

3 結論

本實驗從自然發酵的牦牛酸醡肉中分離出了7株菌(R1，R2，Y1，Y2，Y3，Z1，Z2)，所有菌均具有產蛋白酶活力，其中Y1，Y2，Y3還具有產淀粉酶活力。通過基因測序測定為植物乳桿菌、戊糖片球菌、淀粉液化芽孢桿菌、多粘類枯草芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌亞種、鐮刀霉、黑曲霉。根據其各自產酶分析，得出其中產蛋白酶能力最強的是淀粉液化芽孢桿菌(108.7 U/mL)、多粘類枯草芽孢桿菌(102.75 U/mL)、枯草芽孢桿菌亞種(103.89 U/mL)，其中植物乳桿菌(71.81 U/mL)和戊糖片球菌(75.81 U/mL)也具有較強的產蛋白酶能力；產淀粉酶活性測定結果指出，其產淀粉酶活力分別為淀粉液化芽孢桿菌(74 U/mL)、多粘類枯草芽孢桿菌(64 U/mL)、枯草芽孢桿菌亞種(40 U/mL)。3株芽孢桿菌同時具有產蛋白酶和產淀粉酶活性能充分利用作為發酵粉的青稞中的淀粉進行發酵，屬于優質發酵菌。目前，產蛋白酶微生物以芽孢桿菌和霉菌為主，而本實驗篩選出的2株乳酸菌同樣有著較強的產蛋白酶能力，值得進一步的研究開發。