附子理中丸灌胃后脾陽虛證大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA、神經元細胞μ受體表達觀察

孫大宇，單德紅，劉旭東，劉文俊，王德山

(遼寧中醫藥大學生理教研室，沈陽110847)

中醫藏象理論認為，“脾藏意，在志為思”。脾與人的思維、情感、記憶、行為等有著密切的聯系。脾主運化，化生營氣，以營養意。《靈樞·本神》曰：“脾藏營，營舍意”。只有脾氣旺盛，營血充盛，人體才能進行思維、學習、記憶、情感等行為活動。脾虛患者易出現健忘、注意力不集中、思維不敏捷及智力下降等癥狀，說明脾與精神活動及行為發生有關。海馬組織與學習、空間記憶等行為密切相關。海馬組織相關神經元細胞功能異常、凋亡的發生，可引起機體行為和運動功能的改變。同時阿片肽類多種因子可通過與海馬組織神經元細胞表面豐富表達的受體結合，進而對神經元細胞的功能及活性調節，最終引起機體行為的改變。高表達β內啡肽(β-EP)可使海馬組織神經元細胞功能下降、產生中樞性抑制作用的根源。蛋白激酶A(PKA)是依賴環磷酸腺苷(cAMP)的蛋白激酶，是細胞信號轉導通路中的重要一員。因此，作為脾陽虛證主癥的“神疲、乏力”的發生，可能與海馬組織中樞性抑制作用有關，但其具體發生機制不明確。2016年9月～2017年8月，我們觀察了附子理中丸灌胃的脾陽虛證模型大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA及神經元細胞μ受體表達變化，并分析其可能作用機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物分組 SPF級SD雄性大鼠40只，7～8周齡，體質量(220±10)g，適應性飼養1周，按體質量分層后,采用隨機數字法分為4組：空白對照組(空白組)、脾陽虛模型組(模型組)、附子理中丸治療組(中藥組)、脾陽虛自然恢復組(自愈組)，每組10只。

1.2 脾陽虛證模型模型制備及附子理中丸給藥方法 模型組、中藥組、自愈組采用飲食失節+勞倦等復合因素方法，即飽食1日，禁食2日，每日游泳至力竭，連續2周，制備脾氣虛模型，在此基礎上應用“苦寒瀉下”法，通過連續灌服100%番瀉葉，1 mL/100 g,2次/d，連續2周，制備脾陽虛模型。在模型建立后，中藥組給予附子理中丸1:1水溶液灌胃，給藥量為2 mL/(100 g·d)，1次/d，給藥2周。空白組不施加任何干預因素。模型評價標準[1，2]采用主癥+次癥法，具體如下：主癥為神疲，乏力,體溫下降，便溏，不欲飲；次癥為食少，毛色枯槁無華；評價標準為3項主癥+1項次癥或2項主癥+2項次癥為動物模型復制成功，不符合上述評價標準實驗動物予以剔除。

1.3 大鼠行為運動功能觀察

1.3.1 大鼠行為學觀察 采用曠場實驗檢測各組大鼠行為學改變，評價其中樞性疲勞，即神疲。實驗時將大鼠放入箱體底面中心，實時攝像5 min，觀察大鼠水平運動距離、直立次數。重復3次，取平均值。

1.3.2 大鼠前肢抓力測定 分別于第2、4周末，采用YLS-13A大小鼠抓力測定儀檢測各組大鼠前肢抓力，評價軀體疲勞，即乏力，由專人操作以降低誤差。實驗時，抓持大鼠輕拿輕放，避免激怒，右手將大鼠抓住后按放在抓力板上，左手向前推住抓力板，然后右手向后滑至鼠尾部，左手輕輕松開抓力板，抓力板隨右手拉鼠尾的力量向前滑行，等動物用力抓住抓力板時及時 加力后拉，以得到動物的最大抓力。每只大鼠連續檢測3次，取平均值。

1.4 大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA及神經元細胞μ受體表達檢測

1.4.1 大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA檢測 分別于第2、4周，5%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉大鼠，斷頭分離腦組織，鈍性剝離海馬組織，左側海馬組織置于無菌低溫冷凍管中，-80 ℃保存；右側海馬組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，常溫保存。采用ELISA法：取海馬組織，1∶1加入4 ℃生理鹽水，冰上研磨2 min，低溫高速離心機10 000轉/分，離心10 min，取上清液。大鼠cAMP ELISA Kit試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術開發有限公司，編號：CSB-E07298r)；大鼠β-EP ELISA Kit試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術開發有限公司，編號：CSB-E08206r)；大鼠 PKA ELISA Kit試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，編號：D730517-0096]，所有操作均嚴格按照按照試劑盒說明書操作。應用 Bio-Rad美國伯樂iMark酶標儀檢測海馬組織β-EP、cAMP、PKA。實驗重復3 次，取平均值。

1.4.2 大鼠海馬組織神經元細胞 μ受體檢測 采用免疫組化SABC法。4%多聚甲醛固定海馬組織，常規石蠟包埋切片，PBS 沖洗3次×5 min；室溫正常山羊血清封閉20 min；滴加兔抗大鼠μ抗體(北京博奧森生物技術有限公司，編號：bs-1195R)，4 ℃過夜，PBS 沖洗3次×5 min；滴加生物素標記羊抗兔IgM抗體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次×5 min；加入SABC 試劑，37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照采用抗體稀釋液代替一抗，步驟同上。利用 BI-2000系統，在光鏡下(10×20倍)選取相同部位相同視野照相分析，計算每個視野陽性染色的平均光密度OD值。陽性表達神經元細胞表現為細胞膜呈現褐色或深棕色顆粒附著，平均光密度增強。重復3 次，取平均值。

2 結果

2.1 大鼠水平運動距離、直立次數比較 各組大鼠水平運動距離、直立次數比較見表1 。

2.2 大鼠前肢抓力比較 中藥組、自愈組、模型組、空白組大鼠前肢抓力分別為(1 686.27±180.20)、(1 582.33±180.74)、(1 225.61±122.90)、(1 551.53±158.68)g，與空白組比較，模型組大鼠前肢抓力下降(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和自愈組大鼠前肢抓力增強(P均<0.01)。

表1 各組大鼠水平運動距離、直立次數比較

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01；與中藥組比較，#P<0.01。

2.3 大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA含量比較 各組大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA含量比較見表2。

表2 各組大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA含量比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與中藥組比較，#P<0.05 。

2.4 大鼠海馬組織神經元細胞μ受體光密度比較 中藥組、自愈組、模型組、空白組大鼠μ受體光密度分別為62.96±10.20、78.18±6.14、83.78±7.44、58.38±8.02。與空白組比較，模型組、自愈組大鼠海馬組織μ受體光密度升高(P均<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠海馬組織中神經元細胞μ受體光密度降低(P<0.05)；與自愈組比較，中藥組大鼠海馬組織中神經元細胞μ受體光密度降低(P<0.05)。

3 討論

中醫學認為脾陽虛證多由脾氣虛證基礎上，寒邪傷及脾陽所致，其表現為在脾氣虛所致食少納呆、腹脹腹瀉、神疲乏力等癥狀基礎上，出現形寒肢冷、四肢不溫、大便稀溏、腹痛綿綿等臨床癥狀。中醫藏象理論認為，“脾在體合肉，主四肢”。脾之與肉，在生理上，脾運化水谷，化生氣血，以充養肌肉，肌肉健壯而有力。《素問·陰陽應象大論》曰：“脾生肉”，《素問·平人氣象論》亦曰：“脾藏肌肉之氣”等，都說明了肌肉賴以脾化生的氣血充養。若脾失健運，氣血乏源，濡養不足以致肌肉痿軟，四肢倦怠無力。故有《難經·十六難》關于“怠墮嗜臥，四肢不收，有是者，脾也”的論述。“脾藏意，在志為思”。脾與人的思維、情感、記憶、行為等有著密切的聯系。脾主運化，化生營氣，以營養意。《靈樞·本神》曰：“脾藏營，營舍意”。只有脾氣旺盛，營血充盛，人體才能進行思維、學習、記憶、情感等行為活動。臨床上脾虛患者易出現健忘、注意力不集中、思維不敏捷及智力下降的表現，就體現了脾與精神活動和行為發生的密切關系。附子理中丸(湯)是中醫“溫中健脾”法治療脾陽虛證的經典方劑，由張仲景所著《傷寒論》中“理中湯(丸)”(人參、干姜、炙甘草、白術)加附子而成。該方溫中祛寒，補氣健脾，治脾胃虛寒證，自利不渴，嘔吐腹痛，腹滿不食及中寒霍亂，陽虛失血，胸痞虛證，胸痛徹背，倦怠少氣，四肢不溫。

cAMP-PKA信號通路是經典的G蛋白耦聯受體信號轉導通路，可將細胞外激素、神經肽類物質的生物分子信號傳遞至細胞內，引發生相應的物學效應。首先激素及神經肽類物質與受體結合，活化G蛋白偶聯受體(Gi或Gs)將信號首先傳至腺苷酸環化酶(AC)，由它控制cAMP的含量，cAMP決定蛋白激酶A(PKA)的活性，PKA負責很多蛋白的磷酸化，比如受體，離子通道，轉錄因子等等，由此調節細胞內的生物活性反應和平衡。

β-EP是重要的腦腸肽之一，主要依賴于與分布在中樞及外周組織中的阿片受體結合發揮生物學作用。目前研究[3]發現其主要受體有μ、κ、δ等，其生物學功能參與體內神經、精神、內分泌、消化、呼吸、心血管、睡眠、覺醒以及學習、記憶的調節,保持各項功能活動的平衡。β-EP在局部組織中大量蓄積可通過與受體結合抑制cAMP-PKA信號通路的活性，進而引發細胞功能的抑制。同時PKA活性的降低可引起細胞內相應底物的磷酸化活性而引發生物學效應。禁食和過度運動能夠誘發β-EP的過度釋放[4～7]。同時，“飲食失節”和“疲勞”是脾虛證的重要致病因素。呂琳等[8]研究發現，脾虛大鼠胃、腸組織中的β-EP含量明顯高于同期對照組，而垂體、下丘腦和血漿中的β-EP含量明顯低于同期對照組，認為β-EP的紊亂是脾虛證微觀病變特征之一。譚靜等[9]研究發現，脾虛大鼠血漿β-EP和胃動素(MTL)含量較對照組大鼠顯著降低，而生長抑素(SS)含量則升高，提示脾虛癥可能與β-EP分泌和代謝功能紊亂有關。脾虛證中β-EP及其受體在血清、海馬、下丘腦、胃腸道表達異常，提示“脾失健運”狀態下，β-EP對神經-內分泌-免疫網絡調控作用異常，但其細胞信號轉導的機制尚不明確[10，11]。

本實驗研究結果表明，模型組大鼠海馬組織β-EP及其受體高表達，這一細胞外信號的激活，通過G蛋白耦聯受體傳導至細胞內，引起細胞cAMP含量降低，導致PKA合成減少，磷酸化活性下降。β-EP能夠直接激活細胞膜K+通道，引起K+外流，使神經元細胞超極化，降低神經元興奮性，同時抑制細胞內cAMP的合成，降低其生物活性，進一步抑制神經元細胞的活性[12]。亦可以影響Na+-K+-ATP酶活性，使Ca2+大量內流，使細胞膜穩態破壞和超微結構損傷，引發細胞凋亡[13]。由此我們推測海馬組織中β-EP含量和受體的高表達，引發了細胞內cAMP-PKA信號轉導通路活性下調，導致神經元功能的抑制，進而引起模型組大鼠出現中樞性神疲乏力、食少納呆的宏觀表征改變。同時，附子理中丸能夠降低因造模因素施加所導致中樞神經系統的β-EP過度釋放和μ受體高表達變化，改善cAMP-PKA信號通路的活性變化，逆轉β-EP對中樞神經系統的抑制作用。

綜上所述， 附子理中丸可改善脾陽虛證模型大鼠的脾陽虛證“神疲、乏力”等生物學行為，其機制可能為促進海馬組織β-EP含量降低、cAMP及PKA含量升高、神經元細胞μ受體表達增加。