缺氧新生鼠胼胝體神經元-膠質細胞抗原2 、膠質纖維酸性蛋白表達觀察

王曉舟，王宇，張振中，姚瑞芹

(1徐州醫科大學機能學實驗中心，徐州 221004;2徐州醫科大學神經生物學研究中心)

腦白質損傷(WMI)是早產兒特有的腦損傷形式之一，WMI的病理特點主要包括反應性星形膠質細胞和小膠質細胞活化、少突膠質前體細胞(OPCs)損傷導致的髓鞘形成障礙和軸突病變等，多數WMI患兒會表現出感覺、運動和認知功能等障礙[1, 2]。目前臨床尚無WMI的有效根治措施。胎兒腦組織少突膠質細胞系以OPCs為主，人孕23～32周時胎兒腦組織OPCs對缺氧條件最敏感，缺氧可導致OPCs損傷，使少突膠質細胞分化成熟障礙，最終導致WMI[3]。OPCs標記物神經元-膠質細胞抗原2(NG2)，星形膠質細胞標記物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)可用于顯示缺氧損傷后OPCs和星形膠質細胞的數目變化情況。目前國內外通常采用新生鼠缺氧缺血(hypoxia-ischemia，HI)的方法來制作WMI動物模型，從而進一步研究WMI的發病機制及相應治療措施[4～7]。6%、8%氧氣濃度均能成功建立缺血缺氧WMI模型，但兩者造成的腦組織損傷程度及具體作用機制目前尚不清楚。2014年3月～2016年4月，我們觀察了缺氧新生大鼠胼胝體NG2、GFAP的表達變化，旨在為WMI的發病機制研究提供相關理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 新生3 d Sprague-Dawley(SD)大鼠36只及其母鼠，SPF級，雌雄不限，由徐州醫科大學實驗動物中心提供，動物生產和使用許可證號碼分別為SCXK(蘇)2005-0005和SYXK(蘇)2005-0018。兔抗神經元-膠質細胞抗原2(neuron-glial antigen 2，NG2)抗體購自 Millipore公司，雞抗膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體購自 Novus Biologicals公司，山羊抗兔IgG/FITC熒光二抗購自Santa Cruz公司，驢抗雞IgG/TRITC熒光二抗購自Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 動物分組及HI損傷模型制作方法 取 SD大鼠36只，隨機分為對照組、低濃度組(6%氧)、高濃度組(8%氧)各12只。對照組新生鼠不做任何處理。低、高濃度組制作HI損傷模型：大鼠吸入乙醚吸入麻醉，仰臥位固定四肢、頭部，消毒頸部皮膚，無菌條件下作頸部正中約0.5 cm切口；逐層分離皮下組織，分離右側頸總動脈(氧損傷側)后結扎，縫合皮膚；術后待大鼠麻醉清醒后放回母鼠籠中，恢復2 h；取兩組新生鼠，置于ZKY-4F智能控氧儀缺氧倉(杭州艾普儀器設備有限公司)，缺氧倉置于37 ℃恒溫水浴箱，低、高濃度組分別用6%、8%氧氣濃度混合氮合氣，2 L/min持續灌注2 h。造模成功后將兩組新生鼠放回母鼠身邊常規喂養。

1.3 腦組織切片制備及NG2、GFAP檢測方法 采用免疫熒光染色法。分別于造模2、3、4周時各組取4只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉后，用溫生理鹽水及預冷的4%多聚甲醛行心臟灌流術進行腦組織固定，待大鼠四肢和尾部僵直、肝臟變白變硬后停止灌注。斷頭取腦，鼠腦冠狀位分別切大鼠氧損傷側及對照側組織，置于4%多聚甲醛4 ℃后固定12 h。20%、30%梯度蔗糖脫水，OCT(日本櫻花)包埋，連續切20 μm片，-80 ℃備用。選取切片用0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。加入含有5% BSA、0.3% Triton X-100的PBS 37 ℃封閉40 min。分別滴加抗NG2(1∶1 000)和GFAP(1∶1 000)抗體， 4 ℃孵育過夜；PBS充分洗滌后加相應的二抗(1∶200)，室溫孵育1.5 h，DAPI染核5 min。每只大鼠選取3張切片，每組共選取12張切片，熒光顯微鏡下觀察拍照,使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計數200倍顯微鏡下胼胝體部位免疫熒光陽性細胞數。

1.4 各組大鼠存活情況觀察 造模4周時觀察各組大鼠存活情況(不包括手術過程中死亡新生鼠)。

2 結果

造模2、3、4周時各組氧損傷側及氧損傷對照側腦組織NG2陽性細胞數比較見表1、圖1。

表1 造模2、3、4周時各組氧損傷側及氧損傷對照側腦組織NG2陽性細胞數比較(個

注：與氧損傷對照側比較，*P<0.05；與低濃度組氧損傷側比較，#P<0.05。

造模2、3、4周時各組氧損傷側及氧損傷對照側腦組織胼胝體GFAP陽性細胞數比較見表2、圖2。

造模4周時，低濃度組、高濃度組、對照組大鼠分別存活9、10、12只。與低濃度組比較，對照組、高濃度組大鼠存活數目多。

圖1 造模2、3、4周時各組氧損傷側及氧損傷對照側腦組織NG2表達

組別 GFAP陽性細胞數造模2周造模3周造模4周 低濃度組 氧損傷側499.1±18.7256.0±19.5212.9±26.3 氧損傷對照側792.7±14.4*500.7±20.7*405.3±25.2*高濃度組 氧損傷側353.1±9.1217.1±19.4206.7±24.8 氧損傷對照側597.9±13.6*#404.9±23.0*#375.2±23.7*

注：與氧損傷對照側相比，*P<0.05；與低濃度組氧損傷側相比，#P<0.05。

圖2 造模2、3、4周時各組氧損傷側及氧損傷對照側腦組織GFAP表達

3 討論

迄今為止，新生兒腦白質損傷疾病尚無有效的治療方法，主要原因在于損傷的機制不清。因此，需要一個能夠準確模擬該疾病發生發展過程的動物模型來闡明腦白質損傷的機制，進而為新生兒腦白質疾病治療提供實驗依據。研究[4, 7]表明，新生大鼠缺血缺氧誘導的腦白質損傷模型制作簡單、方便，能較好模擬臨床新生兒腦白質損傷，是研究和治療腦白質損傷疾病的理想動物模型。6%氧損傷和8%氧損傷都能成功建立缺血缺氧腦白質損傷模型，但兩者具體損傷區別和機制還不清楚，新生3 d的SD大鼠6%和8%氧損傷哪個更適合制作研究和治療腦白質損傷疾病的大鼠動物模型，目前亦未見詳細有報道。

新生兒缺氧缺血性腦白質損傷是造成慢性神經系統功能障礙的主要原因。OPCs作為未成熟的少突膠質細胞，可在體內增殖、遷移、分化、成熟，形成髓鞘發揮作用[8～10]，但也有研究[11]表明，OPCs極易受到HI損傷的影響，在缺血后的24和48 h，OPCs的數量有短暫性減少，其大小和形態轉向更未成熟的形式，并且發現OPCs可能出現了遷移。另有研究[12]表明，HI損傷后14 d損傷半球有增殖細胞大量的存在，在損傷后21～35 d，胼胝體產生的少突膠質細胞數量是對照組4倍，而損傷后35 d，少突膠質細胞、星形膠質細胞等大量表達于損傷側胼胝體區。這表明在HI損傷后初期OPCs受到急性損傷，之后HI損傷信號可能迫使SVZ區或胼胝體區的神經干細胞和少突膠質前體細胞的增殖，補充受損的OPCs，因此造成損傷側NG2陽性細胞數急劇增加，所以HI損傷后2周時NG2(OPCs標記物)陽性細胞大量表達。6%氧損傷組較8%氧損傷組損傷嚴重，可能是由于受局部不利微環境的影響，受到損傷的OPCs相對較多，所以損傷后2周時OPCs的數目較8%少。而造模3周和4周時，8%氧損傷組損傷程度較低，相對于6%氧損傷組有更多OPCs分化成了少突膠質細胞，導致OPCs減少，故在OPCs數量上6%氧損傷組與8%氧損傷組相比，差異無統計學意義。結果提示，6%氧損傷組OPCs的減少可能是由于受到嚴重損失后微環境內平衡失調，導致OPCs向少突膠質細胞分化的效率降低，致使髓鞘發育受阻，而8%氧損傷組OPCs的減少是因為損傷較輕，更多的OPCs可以向少突膠質細胞分化，OPCs數量同樣減少，所以結果顯示6%氧損傷組損傷側NG2的表達量僅在2周顯著低于8%氧損傷組，而造模3周、4周時兩組均無顯著性差異。

星形膠質細胞是影響中樞神經系統病理損傷后髓鞘再生的一個重要因素，其主要作用于細胞外的基質，神經系統損傷后它們會被激活并形成膠質瘢痕，但過度的瘢痕組織形成對中樞神經系統神經修復和再生起到抑制作用[13～16]。本研究檢測到星形膠質細胞標記物GFAP在HI損傷后2周時大量表達，并且這種現象持續到損傷后第3周和第4周。 6%氧損傷組損傷側GFAP陽性細胞數在2周和3周時顯著高于8%氧損傷組損傷側，4周時兩組無顯著性差異。以上實驗數據表明，HI損傷后2周至4周，大鼠損傷側胼胝體星形膠質細胞增殖，2周增殖最顯著，且6%氧損傷組較8%氧損傷組促星形膠質細胞增殖更加顯著，激活星形膠質細胞可能會抑制OPCs向少突膠質細胞分化，以及阻礙髓鞘的形成。

本研究使用新生3 d SD大鼠建立缺血缺氧模型，對其右側頸總動脈結扎，并分別給予6%氧和8%氧2 h造成缺氧損傷。實驗亦觀察了不同缺氧模擬WMI 4周后大鼠的存活率，8%氧損傷組存活率與對照組相比差異無統計學意義，但6%氧損傷組存活率顯著低于對照組，提示過度缺氧可能會對造模動物造成更為嚴重的損傷，從而致死。新生3 d大鼠6%或8%氧損傷可誘使OPCs表達，但同時6%氧損傷較8%氧損傷會大量促進星形膠質細胞增殖，可能導致OPCs向少突膠質細胞分化的過度抑制，從而造成腦白質損傷加重，導致6%氧損傷組大鼠模型存活率明顯減低，因此，我們認為8%氧損傷更適合建立SD大鼠HI模型。

綜上所述，缺氧可導致新生大鼠胼胝體NG2 、GFAP表達升高。6%、8%氧濃度均可導致新生大鼠胼胝體NG2 、GFAP表達升高，且8%氧濃度作用更強。