轉移因子對豬淋巴細胞E玫瑰花結百分率影響的測試研究

徐 磊 薛 萍 林祚貴 劉俊斌 譚禮寧 劉小龍王曉斌 葉盛聰 楊 慧 黃 瑜 朱國強＊

（1.福建農業職業技術學院 福州 350119；2.揚州大學獸醫學院 江蘇揚州 225009；3.派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500；4.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013）

轉移因子（Transfer Factor，TF）是白細胞內可透析、具有生物活性的非均一小分子混合物，是一種細胞因子。其成分復雜，主要含有多肽和核糖，以及多種游離氨基酸和 Na、Mg、K、Ca、Zn 等金屬元素[1-6]。TF是具有特異和非特異性免疫活性的細胞調節因子，可特異或非特異的調節機體免疫狀態，增強機體免疫水平，是一種新型、有效、安全的免疫調節制劑[7-10]。

試驗按照本課題組已獲授權國家發明專利制備TF[11-13]，通過肌肉注射TF研究其對豬淋巴細胞E玫瑰花結百分率的影響，揭示TF發揮免疫增強作用的一些機理，為獸用TF的臨床應用提供相關試驗參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉、葡萄糖、碳酸氫鈉、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、姬姆薩染料和臺盼藍均購自國藥集團化學試劑有限公司；戊二醛、甘油和甲醇均購自西隴化工股份有限公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；光學顯微鏡為日本Nikon公司產品，型號ECLIPSE E100。

1.2 試驗動物 同窩健康檢驗用仔豬12頭，均于20日齡斷乳，斷乳后于全排風正壓恒溫恒濕檢驗豬舍隔離飼養，25日齡時隨機分為2組，分別為：試驗組和對照組，隔離飼養，每組各6頭豬。

1.3 TF制備 按照本課題組已獲授權的國家發明專利制備TF[11-13]：以健康豬脾臟為原料，經勻漿、細胞破碎、滅活、微濾、超濾后精制而成。經檢驗，所制備TF的pH值為7.1，多肽含量為3.2 mg/mL，核糖含量為92.0 μg/mL，脫E受體法效力檢驗活力為16%，細菌內毒素含量小于10 EU/mL，在251 nm波長處有最大吸收峰，OD260nm/OD280nm比值為2.22，蛋白質定性檢驗、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、熱原檢驗、異常毒性檢查、過敏反應檢查、安全檢驗均合格。

1.4 試驗設計 同窩健康檢驗用仔豬25日齡時，試驗組注射TF，對照組注射生理鹽水，各組注射劑量均為2.0 mL/頭。分別于注射前第3 d及注射后第3 d、7 d、14 d、21 d 采集外周血，阿氏液抗凝，用于檢測仔豬外周血淋巴細胞E玫瑰花結百分率。所得數據用單因素方差分析和最小顯著性差法（LSD）分析，P＜0.05為差異顯著。

1.5 豬外周血淋巴細胞E玫瑰花結百分率的測定

1.5.1 試劑配制

1.5.1.1 Hank's液 將0.3%磷酸二氫鉀溶液、0.76%磷酸氫二鈉溶液、2%氯化鉀溶液及20%氯化鈉溶液依次按20 20 20 40比例混合，加葡萄糖1.0 g，溶解混勻，用水稀釋至1 000 mL，并用4%碳酸氫鈉溶液調節pH值至7.2～7.3（臨用時配制）。

1.5.1.2 阿氏液 取氯化鈉0.420 g、枸櫞酸0.055 g、枸櫞酸鈉0.766 g、葡萄糖 2.05 g，加水溶解并稀釋至100 mL，滅菌。

1.5.1.3 分離液 為淋巴細胞分離液。

1.5.1.4 羊血 取綿羊靜脈血5.0 mL，加入5.0 mL阿氏液中，冰箱保存。

1.5.1.5 固定液 取25%戊二醛溶液、3.5%碳酸氫鈉溶液及Hank's液依次按1 1 38比例混合。

1.5.1.6 姬姆薩染色液原液 取姬姆薩染料0.5 g，加甘油33 mL，55～60℃加熱至姬姆薩染料溶解，冷至室溫，加入33 mL甲醇，室溫放置24 h后用濾紙過濾，濾液即為原液。密封室溫保存。

1.5.1.7 染色液 取姬姆薩染色液原液2.0 mL，加Hank's液6.0 mL，搖勻，以1 500 r/min離心10 min，取上清液待用。

1.5.1.8 0.5%臺盼藍溶液 1%臺盼藍溶液與1.7%NaCl等體積混合，用濾紙過濾。

1.5.2 淋巴細胞E玫瑰花結百分率測定的操作法

1.5.2.1 豬淋巴細胞懸液制備 取豬抗凝血，加等量Hank's液稀釋成細胞懸液后輕輕加入到已含有等量分離液的離心管中。以2 000 r/min離心20 min，小心吸出中間層的淋巴細胞，放入另一離心管中，加適量Hank's液洗滌，搖勻，以1 500 r/min離心3～5 min，棄去上清，再洗滌一次后用Hank's液適當稀釋，用臺盼藍染色并計數活細胞數(＞95%)，使最終淋巴細胞濃度為（3×106）～（5×106）個/mL。

1.5.2.2 綿羊紅血球懸液的制備 取適量羊血，用適量Hank's液洗三次（同前）。棄去上清液，加適量Hank's液稀釋并計數，使最終濃度為豬淋巴細胞懸液濃度的8～10倍。

1.5.2.3 測定 每支小試管均加入豬淋巴細胞懸液0.2 mL，再分別加入綿羊紅細胞懸液0.2 mL，混勻，37℃水浴5 min，500 r/min離心3 min，置4℃冰箱過夜。次日取出，棄去上清液，每管中各加入固定液1滴，輕輕搖勻，靜置10 min，加入染色液2滴并搖勻，靜置15 min后開始計數，顯微鏡視野中淡藍色、較大的細胞為淋巴細胞，共數計數板64個大方格上所有淋巴細胞的個數 (不少于200個)，統計其中E玫瑰花結形成的細胞數 (結合3個以上綿羊紅細胞的淋巴細胞)，求得E玫瑰花結百分率。

2 結 果

結果顯示，注射TF后，試驗組仔豬外周血淋巴細胞E玫瑰花結百分率明顯提高，于注射TF后第7 d達到峰值（54.3%）；而對照組仔豬外周血淋巴細胞E玫瑰花結百分率較穩定，維持在31.2%左右，見表1。

試驗組仔豬外周血淋巴細胞E玫瑰花結百分率，于注射TF后第3 d、7 d及14 d均顯著高于對照組（P＜0.05），分別比對照組提高了 14.6%、22.0%和 14.9%，見圖 1-圖2。

結果表明，TF能顯著提高豬外周血淋巴細胞E玫瑰花結百分率。

3 討 論

1949年，Lawrence首次發現結核菌素陽性供體的活淋巴細胞能使皮試陰性受體轉變為皮試陽性。1953-1955年，Lawrence等將結核菌素陽性供體的白細胞可透析物質 （Dialyzable Leukocyte Extract，DLE）重復試驗后，發現DLE具備活淋巴細胞同樣的功能，即DLE仍具有轉移遲發型變態反應的作用，并把能引起這種效應的物質稱為 “轉移因子”[1-3]。

表1 E玫瑰花結百分率結果

圖1 對照組E玫瑰花結形成圖例

圖2 試驗組E玫瑰花結形成圖例

自20世紀50年代發現TF至今，國內外許多學者對TF的制備方法、理化特性、生物學特性、免疫特性、熱原性、毒性及安全性進行了廣泛、深入的研究，發現TF具有分子質量小、無毒、無抗原性、不引起過敏反應，不產生對抗抗體且可超越種系界限應用等優點，并且在TF治療免疫缺陷、惡性腫瘤、各種感染性疾病等方面進行了治療試驗研究，均取得一定的療效。1979年以后，逐漸將TF應用于獸醫免疫和臨床治療，在動物疾病防控中發揮了一定作用[7-17]。

淋巴細胞是機體最主要的免疫活性細胞，其中T細胞介導細胞免疫。淋巴細胞E玫瑰花結百分率可以反映機體的細胞免疫水平，可作為機體免疫功能的測試指標之一[18-19]。TF可非特異性地增強細胞免疫，進而提高機體免疫功能[7-10]。不同工藝方法制備的TF所含組分差異不大，但各組分的含量和制品效力會有較大差異[11-17]。國內有學者在制備豬脾犬瘟熱五聯疫苗特異性TF時，發現特異性TF在小鼠E玫瑰花環形成率及小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性方面具有顯著的增強效果[20]。在本試驗中，按本發明專利所制備的TF對豬淋巴細胞E玫瑰花結百分率的影響結果顯示，試驗組仔豬外周血淋巴細胞E玫瑰花結百分率，于注射TF后第3 d、7 d及14 d均顯著高于對照組（P<0.05），分別比對照組提高了14.6%、22.0%和14.9%。結果表明，本發明專利所制備的TF具有顯著提高豬免疫功能的作用。

試驗按本課題組已獲授權國家發明專利制備TF[11-13]，通過肌肉注射研究TF對豬淋巴細胞E玫瑰花結百分率的影響，結果顯示TF可顯著提高豬外周血淋巴細胞E玫瑰花結百分率和豬免疫功能。