豬大腸桿菌的分離鑒定及其藥敏試驗

陳敏卿 龍巖市農產品質量安全檢驗檢測中心 福建龍巖 364000

豬大腸桿菌病是由豬致病性大腸桿菌引起的，臨床上主要引起仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，在我國各地均有發生，給生豬養殖業帶來巨大的經濟損失[1-3]。隨著生豬規?；B殖的發展及抗生素的大量使用，同時又因大腸桿菌其血清型眾多，抗原復雜，具有容易產生變異等特性，大腸桿菌菌株已產生廣泛的耐藥性和多重耐藥性。因此，本試驗通過細菌的分離鑒定，并篩選其敏感藥物，從而有效的指導臨床用藥，達到最佳的治療效果。

1 材 料

1.1 病料及來源 病料來源于福建省某規?；i場疑似發生大腸桿菌病的仔豬，無菌采集豬淋巴結、肝臟、脾臟、腸內容物、腸系膜淋巴結等病料。

1.2 材料及試劑 營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基購置廣東環凱微生物科技有限公司；藥敏紙片購置北京天壇藥物生物技術開發公司；DNA提取試劑盒、2×EasyTaq PCR Super-Mix等試劑購置全式金生物技術有限公司。

1.3 試驗動物 清潔級昆明小鼠購置吳氏實驗動物中心。

2 方 法

2.1 細菌分離培養及鏡檢 將病料接種于營養瓊脂培養基，麥康凱瓊脂培養基，伊紅美藍瓊脂培養基37℃培養18～24 h，將可疑的大腸桿菌菌落接種于營養瓊脂平板上，37℃恒溫箱中純化培養12～18 h。挑取單個菌落進行革蘭染色，置于顯微鏡下觀察鏡檢。

2.2 測序鑒定 選用通用引物27F/1492R擴增細菌 16S rRNA。 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'，1492R：5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反應條件為：94 ℃預變性 5 min、94 ℃變性 40 s、52 ℃復性 40 s、72 ℃延伸 1 min，35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物經純化和克隆，送往生工（上海）生物工程有限公司進行基因測序，將測序的結果與GenBank中公布的序列進行同源性分析。

2.3 動物致病性試驗 參照文獻方法[4]，將待檢的菌株接種營養肉湯，37℃培養18 h，細菌計數后，將菌液稀釋成1010CFU/mL。10只昆明小鼠隨機分成2組，試驗組腹腔接種0.3 mL菌液，對照組腹腔注射等劑量的生理鹽水，隔離飼養，觀察小白鼠死亡情況。

2.4 藥敏試驗 采用K-B藥敏紙片紙法，將純化的菌落涂布于瓊脂平板上，將藥敏紙片貼于培養基表面，置于37℃恒溫箱培養，24 h后觀察結果，并根據抑菌環直徑來判定試驗結果。

3 結 果

3.1 細菌的分離與鏡檢 經培養，在普通瓊脂培養基上出現灰白色、稍隆起、圓形、濕潤、光滑、邊緣整齊的中等大小菌落（直徑2～3 mm）；在麥康凱培養基上長出磚紅色、光滑、濕潤、圓形隆起、邊緣整齊的菌落。革蘭染色結果為中等大小、兩端鈍圓、散在排列、無芽孢，革蘭陰性桿菌（見圖1）。

3.2 序列測定及鑒定 分離的細菌PCR產物經1%凝膠瓊脂電泳，出現預期的特異性條帶 （見圖2）。將測序結果采用Bioedit軟件參照正反向序列圖譜對序列進行人工校對，然后輸入Genbank用Blastn軟件進行相似性比較，并與數據庫中的序列進行同源性比較，結果發現分離的細菌與GenBank中公布的大腸桿菌16S rRNA序列同源性高達99.9%以上，確定分離的細菌為大腸桿菌。

圖1 革蘭染色結果

圖2 豬大腸桿菌16S rRNA基因PCR結果

3.3 致病性試驗結果 小鼠攻毒后24 h后，試驗組的5只小鼠全部死亡，而對照組無出現死亡。試驗組的發病小鼠出現精神沉郁、低頭昏睡、體溫升高、采食量大幅減少、腹瀉、呼吸加快。剖檢死亡小鼠可見肝臟腫大，有出血點和壞死點，心包淤血，腸道炎癥膨脹，腸腔內充滿水樣稀便，說明本試驗分離的大腸桿菌具有一定的致病性。

3.4 藥敏試驗結果 瓊脂平板經24 h培養，用直尺測量藥敏紙片的抑菌圈直徑，分析該分離菌的藥物敏感藥物（見表1），結果發現該分離菌只對丁胺卡那和頭孢喹肟敏感，而對慶大霉素、恩諾沙星、阿莫西林、強力霉素、磺胺嘧啶鈉和林可霉素都存在不同程度的耐藥性。

4 討 論

1）豬大腸桿菌病在全世界范圍內均有發生，在我國廣泛流行，給生豬養殖業造成巨大經濟損失。病豬主要表現為腹瀉、漿膜性水腫等腸道癥狀，嚴重影響仔豬的健康，死亡率提高[5]。本研究通過對細菌的分離，并通過革蘭染色鏡檢、PCR擴增和克隆測序鑒定，明確了本試驗分離的細菌為豬大腸桿菌。同時，小鼠毒力實驗表明該試驗分離的豬大腸桿菌具有一定的致病性。

表1 藥物敏感試驗結果

2）目前，細菌的鑒定方法主要包括表型鑒定法和分子遺傳學鑒定法兩大類，表型鑒定法主要是對細菌形態和生理生化進行鑒定，而分子遺傳學鑒定法是核酸水平的鑒定。生理生化表型鑒定常出現不穩定、敏感性不高、測試項目多、費時費力等問題。本試驗先通過表型的細菌形態學觀察初步確定細菌的種類，再通過PCR和16S rRNA序列測定，從分子遺傳學水平對分離的細菌進一步鑒定，快速、準確的從細菌的表型水平再到分子遺傳學水平對該分離菌進行了鑒定，確保了細菌鑒定的準確性。

3）豬大腸桿菌病感染后，使用敏感抗生素具有一定的效果，但大腸桿菌由于其血清型眾多，抗原復雜，又具有容易產生變異的特性[6]和長期使用同類抗生素會造成細菌的耐藥性，導致治療困難。所以臨床上有必要對發病的豬場進行分離鑒定并進行藥敏試驗，從而指導臨床生產用藥和防治。本試驗藥敏試驗表明分離的豬大腸桿菌對慶大霉素、恩諾沙星、阿莫西林、強力霉素、磺胺嘧啶鈉、林可霉素都表現為耐藥性，只有對丁胺卡那和頭孢喹肟敏感，說明本試驗分離的大腸桿菌株具有多重耐藥的特性，給生產上的治療帶來了巨大的困難。