苦瓜中黃酮類物質(zhì)提取及生物活性分析

葛雅琨，張 臻，張?jiān)?/p>

(吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

苦瓜的果實(shí)營養(yǎng)豐富，藥食兼用.據(jù)現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)分析，苦瓜中富含蛋白質(zhì)、糖、VA、VB、VC及各種必需氨基酸等[1].苦瓜素有“藥用蔬菜”之稱[2,3]，因其不僅有良好的食用價(jià)值，而且還有明顯的藥用功能而得名.中醫(yī)認(rèn)為，苦瓜的全株均可作為藥材使用，歷代臨床應(yīng)用治療腫瘤、痢疾、腸炎、中暑等癥狀.《本草綱目》中記載：苦瓜“苦寒、無毒、除邪熱、解勞乏、清心明目、益氣壯陽”.現(xiàn)代研究證明，苦瓜具有降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗生育、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性.

苦瓜能作為藥用食材與其中所含的黃酮類物質(zhì)密不可分.黃酮類化合物是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物[4].如白果雙黃酮和葛根總黃酮等[5],對心血管疾病有治療作用；木犀草素、羥基芫花素和杜鵑素等能治療氣管炎；竹葉黃酮具有優(yōu)良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等生物學(xué)功效.這些在人類的營養(yǎng)、健康和疾病防治上有著廣闊的應(yīng)用前景[6，7].本實(shí)驗(yàn)研究從苦瓜中提取黃酮類物質(zhì)的方法，并利用體外抑菌實(shí)驗(yàn)[8,9]對其生物學(xué)活性進(jìn)行分析.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

苦瓜，購買自超市；大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)購買于中國普通微生物學(xué)菌種保藏管理中心.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 制備凍干粉

制備凍干粉的方法如下：

(1) 用手術(shù)刀先將苦瓜橫切成兩半，取出其中的苦瓜籽和苦瓜瓤.然后將其切成1.5～2 cm寬的苦瓜條.

(2) 將切好的苦瓜條放入燒杯中，然后將其放置于-40 ℃的冰箱中保存6～8 h左右.

(3) 取出凍好的苦瓜條，放在大托盤中，用手術(shù)刀將苦瓜條切片，每片的厚度大約在1～2 mm之間.

(4) 將切好的苦瓜片平鋪在凍干機(jī)托盤上，鋪好的苦瓜片盡量緊湊，但是應(yīng)避免苦瓜片的重疊；之后將其繼續(xù)放置于-40 ℃的冰箱中過夜保存.

(5) 將苦瓜片用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干.

(6) 將凍干后的苦瓜片轉(zhuǎn)移至研缽中，研磨成粉末.

(7) 將研磨過的粉末過60目篩，苦瓜粉裝入50 mL的EP管中，用石蠟?zāi)し饪冢龊脴?biāo)記并放于-20 ℃的冰箱中保存；并將未能過濾的苦瓜片放入研缽中繼續(xù)研磨，直到苦瓜粉完全通過篩子為止.

1.2.2 粗提

分別用丙酮和75%的乙醇溶液作為溶劑，采用固液浸提法、超聲波提取法、超聲法與浸提法混合的方法和索氏提取法等多種不同的方法對苦瓜粉中的黃酮類進(jìn)行初步的提取.此外，對各種方法都進(jìn)行了3組不同的溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃)作為對照，以便選擇出最佳的提取方法及最佳的溫度.

1.2.3 測定粗提物的黃酮含量

用分光光度計(jì)法[10-12]測出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在各濃度下的吸光度，并用同種方法測量各種方法得到的濃縮液，以及各濃縮液稀釋兩倍后的吸光度.

1.2.4 高效液相色譜法檢測

將測得吸光度最大的兩組粗提物通過濾膜過濾后吸取20 μL，注入高效液相色譜儀中分別進(jìn)行檢測，30 min后得到圖譜.

1.2.5 分離純化

將5 ml黃酮濃度最高的粗提液加入到具有聚酰胺樹脂的分離柱中，然后用30%，50%，70%，90%的乙醇溶液依次進(jìn)行洗脫，各得50 mL，并將洗脫液濃縮到5 mL.

1.2.6 生長曲線測定

(1) 配置LB液體培養(yǎng)基，分別取10 mL裝入7支試管中并用呼吸膜封口.

(2) 采用高壓蒸氣法對其進(jìn)行滅菌(121 ℃，20 min).

(3) 在無菌操作下，取50 μL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌加入6支試管中(每種菌兩支試管)，并做好標(biāo)記，金黃色葡萄球菌記為1、2，大腸桿菌記為3、4，而銅綠假單胞菌則記為5、6，7號為空白試管.

(4) 在1、3、5加入200 μL的濃縮液(測得抑菌圈最大的一組所采用的方法得到的)，向2、4、6號試管中加入等體積無菌水作對照并套上呼吸膜.

(5) 搖勻后將7支試管放在37 ℃，130 r/min的搖床上培養(yǎng).

(6) 1 h后，取出試管后，在無菌環(huán)境下，從7支試管中分別用移液槍吸取200 μL液體加入96孔板中(盡量使移液槍在各支試管的同一位置吸取).

(7) 再向前六支試管中分別補(bǔ)加200 μL的滅菌后的培養(yǎng)液，7號棄用，套上呼吸膜后將6支試管放入搖床中繼續(xù)培養(yǎng).

(8) 將96孔板放入酶標(biāo)儀中，測量600 nm的吸光度，7號為空白樣.

(9) 重復(fù)步驟(5)、(6)、(7)、(8)依次測2、4、6、8、24 h后的吸光度，并做好記錄.

1.2.7 黃酮的定性測定

(1) 鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取適量待測樣品置于試管中，加少許鎂粉振蕩，滴加4～5滴的濃鹽酸，水浴加熱2 min，觀察、記錄顏色變化.

(2) 氨熏試驗(yàn)：取適量待測樣品于濾紙片上，稍干，置于濃氨水瓶口熏30 s，觀察顏色變化.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取劑提取總黃酮含量

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品測定其在510 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以衡量提取物中總黃酮的含量.蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示.

蘆丁濃度/(g·mL-1)圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品吸光度

在不同提取劑作用下，1 g苦瓜粉的提取濃縮液稀釋20倍后，測得吸光度以及經(jīng)計(jì)算得出的總黃酮含量如表1、2所示.結(jié)果表明，以75%的乙醇為提取劑時(shí)，60 ℃時(shí)浸提與超聲相結(jié)合的方法最佳；以丙酮作為提取劑時(shí)，70 ℃索氏提取和60 ℃時(shí)浸提與超聲相結(jié)合的方法最佳；而索氏提取存在的缺陷是，由于丙酮在70 ℃時(shí)已達(dá)到沸點(diǎn)，由于其密封效果不好，丙酮揮發(fā)較多導(dǎo)致濃度相應(yīng)的提升，并且擴(kuò)散到空氣中對人體也存在一定的損傷.所以應(yīng)選取60 ℃時(shí)，浸提與超聲相結(jié)合的方法作為最佳提取方法.以下實(shí)驗(yàn)所用提取物均是以這種方法提取得到的.

表1 不同溫度及不同方法75%乙醇提取的總黃酮含量及其吸光度

表2 不同溫度及不同方法丙酮提取的總黃酮含量及其吸光度

2.2 對提取物成分進(jìn)行定性分析

(1) 鹽酸-鎂粉反應(yīng)顯示，各級提取物呈現(xiàn)不同程度的紫紅色，即：各級提取物中均含有黃酮類物質(zhì).

(2) 氨熏試驗(yàn)結(jié)果顯示，紫外燈下，各級提取物在濾紙上呈現(xiàn)不同程度黃褐色熒光斑點(diǎn)，也就是在各級提取物中均含有黃酮類物質(zhì).

(3) 采用高效液相色譜法將提取物濃縮液中的總黃酮進(jìn)行定性分析.

如圖2所示，將兩種濃縮液所得圖譜與分別用蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜所對照可發(fā)現(xiàn)，粗提物中不含有(或較少量含有)類似蘆丁和槲皮素這兩種黃酮類物質(zhì)，所以，提取物中的黃酮類物質(zhì)可能是其他類別的黃酮類物質(zhì)，還有待于進(jìn)一步研究.

a.以75%乙醇為溶劑濃縮液的色譜圖

b.以丙酮為溶劑濃縮液的色譜

c.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的色譜

d.槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖圖2 高效液相色譜圖

2.3 丙酮和75%乙醇初步提取物的抑菌效果

選取丙酮和75%乙醇提取物，作用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌,測定其生長曲線，結(jié)果如圖3所示.對大腸桿菌的生長曲線來說，丙酮和75%乙醇的提取液對其產(chǎn)生的抑制作用比較微弱；對金黃色葡萄球菌來說，兩種提取液對其都具有抑制作用，并且抑制效果比較接近；而這兩種提取液對銅綠假單胞菌具有較強(qiáng)的的抑制效果，而丙酮作為提取劑對其抑制作用最好.

培養(yǎng)時(shí)間/ha.不同提取物作用于大腸桿菌

培養(yǎng)時(shí)間/hb.不同提取物作用于金黃色葡萄球菌

培養(yǎng)時(shí)間/hc.不同提取物作用于銅綠假單胞菌圖3 不同提取物作用下大腸桿菌(a)、金黃色葡萄球菌(b)和銅綠假單胞菌(c)的生長曲線

2.4 聚酰胺分離產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果

分別將75%乙醇和丙酮提取物濃縮液進(jìn)行聚酰胺樹脂分離，以30%，50%，70%，90%乙醇溶液洗脫，得到4種不同濃度的洗脫液，濃縮后，測定其對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生長曲線的影響，鑒于2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步提取物對大腸桿菌的抑菌作用一般，所以本實(shí)驗(yàn)中不再對大腸桿菌進(jìn)行研究.分離后的提取物作用于金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4、圖5.

由圖4可以看出，丙酮提取物經(jīng)聚酰胺分離后，以70%乙醇洗脫得到的物質(zhì)能最大程度的抑制金黃色葡萄球菌的生長.

圖4 聚酰胺分離后不同洗脫液作用于金黃色葡萄球菌

由圖5可以看出，同樣是丙酮提取物經(jīng)聚酰胺分離后，以70%乙醇洗脫得到的物質(zhì)能最大程度的抑制銅綠假單胞菌的的生長.相比較丙酮提取物而言，75%乙醇的提取物經(jīng)聚酰胺分離后也是70%乙醇洗脫得到的產(chǎn)物抑制兩種菌的效果最好，但是均不及丙酮提取物經(jīng)聚酰胺分離后，70%乙醇洗脫得到的抑菌效果好.這可能顯示了在本實(shí)驗(yàn)條件及方案下，丙酮作為提取劑，對抑菌有效成分的提取優(yōu)于75%的乙醇提取劑，但是所提取的具體有效成分，還有待于進(jìn)一步研究.

圖5 聚酰胺分離后不同洗脫液作用于銅綠假單胞菌

3 結(jié) 論

(1) 以丙酮和75%的乙醇為提取劑時(shí)，采用60 ℃，浸提與超聲相結(jié)合的方法提取總黃酮效果最佳；

(2) 定性分析結(jié)果顯示提取液中含有黃酮類物質(zhì)，但是HPLC分析結(jié)果表明，所提取的黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同于蘆丁和槲皮素；

(3) 抑菌試驗(yàn)顯示丙酮和75%乙醇的提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌來說，抑菌作用大腸桿菌<金黃色葡萄球菌<銅綠假單胞菌，而且丙酮作為提取劑對銅綠假單胞菌的抑制作用最好；

(4) 粗提取經(jīng)聚酰胺分離后，70%乙醇洗脫液對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌抑菌效果最好，揭示其包含有效的抑菌成分.