水解蛇蛻的幾種方法及水解產物的生物活性研究

蔣凱 嚴發展 丁秦超 陳鑫珉 梁文星 丁濱

摘 要：目的 比較幾種蛇蛻水解方法的水解效率，并以HaCaT細胞評價水解產物的生物活性。方法 利用乙酸、NaOH、氧化還原兩步法在不同溫度和時間條件下水解蛇蛻；利用茚三酮法、考馬斯亮藍法檢測水解產物中氨基酸及多肽的含量；用HPLC測定提水解產物分子量；利用HaCaT評價水解產物的生物活性。結果 酸水解的最適條件為80℃、2.5mol/L乙酸反應6h；堿水解的最適條件為80℃、0.625mol/L NaOH反應6h；氧化還原水解法最適試劑濃度分別為6%過硫酸氫鉀、4mol/L尿素、1.25%亞硫酸氫鈉；通過上述方法獲得的膠原蛋白多肽分子量約為1kDa。該多肽能夠促進細胞體外增殖。

關鍵詞：蛇蛻；多肽；水解；生物活性

中圖分類號：R932 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2018）29-0032-03

Abstract： Objective： The hydrolytic efficiency of several snake slough hydrolysis methods was contrastively studied， and bioactivity of the hydrolysate was evaluated with HaCaT. Methods： The snake slough was hydrolyzed by acetic acid， NaOH and two-step redox methods at different temperatures and time. The contents of amino acids and peptides in the hydrolysates were determined by ninhydrin and coomassie brilliant blue methods， respectively. The molecular weight of hydrolyzed products was determined by HPLC. The HaCaT was used to evaluate the biological activity of the hydrolysate. Results： The optimal conditions of acidic or alkalic hydrolysis methods were as follows： 2.5 mol/L acetic acid at 80°C for 6 h， 0. 625 mol/L NaOH at 80°C for 6 h. And the optimum reagents for redox hydrolysis was 6% potassium persulfate， 4 mol/L urea assemble 1.25% sodium bisulfite. The molecular mass of the hydrolysate was about 1 kDa. The hydrolysate could promote the cell proliferation in vitro.

Keywords： snake slough； polypeptide； hydrolysis； biological activity

蛇蛻[1]是游蛇科動物的干燥表皮膜，有龍子衣、蛇符、龍衣之稱。性咸、甘、平，入肝、脾經，具有祛風、解毒、定驚、退翳的功能，富含無機鹽、氨基酸、膠原蛋白等成分，可通過水解獲得。膠原蛋白因其較好的物理性能和生物學特性，廣泛用于醫療器械、食品添加、化妝品生產等領域[2-4]。目前國內外學者就膠原蛋白生物材料的構建已開展了大量工作[5-6]，其中主要集中在哺乳動物和水生動物來源的膠原蛋白上，而爬行動物來源的膠原蛋白開發研究尚不完善。本研究比較了幾種不同水解蛇蛻的方法，并初步判斷水解產物的分子量大小，驗證了水解產物的生物活性。為蛇蛻水解產物的開發和應用提供了實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗中的化學及生化試劑均購自華東醫藥（上海）有限公司。蛇蛻經過浙江中醫藥大學丁志山教授鑒定分別為中華眼鏡蛇（Naja atra）尖吻蝮蛇（Deinagkistrodon acutus）和大王蛇（Elaphe carinata）。

1.2 方法

1.2.1 蛇蛻氨基酸組成的對比分析。取1g蛇蛻粉，用10mL 6mol/L鹽酸經N2除氧密封后置于110℃油浴中水解24h，獲得的水解產物用德國Sykam全自動氨基酸分析儀分析。

1.2.2 蛇蛻水解。堿、酸水解：取蛇蛻按質量體積比1：100分別加入不同濃度的NaOH溶液或冰醋酸溶液于4℃、40℃、80℃水浴中水解4天、24h和6h停止水解。以上水解產物置于截留分子量為1000的透析袋中浸泡在pH7的PBS溶液，至樣品pH近中性。氧化還原提取：稱取洗凈干燥的蛇蛻浸沒在一定濃度的過氧化氫鉀溶液中，30℃恒溫水浴加熱60min后用蒸餾水洗凈，并浸沒于4%尿素、1% SDS、1.25%亞硫酸氫鈉混合液，40℃恒溫水浴加熱4h，高速離心5min，取上清并調節pH至中性，-20℃冷藏。

1.2.3 氨基酸和蛋白質含量的測定。采用茚三酮分光光度計法測定氨基酸含量，考馬斯亮藍法測定蛋白含量。

1.2.4 HPLC分析水解產物。分別以乳球蛋白（35kDa）、肌紅蛋白（16.9kDa）、核糖核酸酶A（13.7kDa）、尿苷

（244kDa）等11種蛋白質為標準品。用Phenomenex提供，型號 BioSep-SEC-s2000，規格300×7.80mm的柱子，以100mmol/L磷酸鹽緩沖液為流動相，流速1.0mL/min分析。并以分子量對數為y軸，出峰時間為x軸，制作蛋白分子量標準曲線。以上述條件同時分析蛇蛻水解樣本。

1.2.5 細胞活性實驗。用不同濃度的蛇蛻水解物水溶液在37℃包被細胞培養板2h，棄去上清液后，用生理鹽水潤洗兩次。將105個/mL HaCaT細胞轉接入已包被好的培養板內，24小時之后計數各組細胞數，用試劑盒檢測培養液中乳酸脫氫酶（LDH）活性。

2 結果

2.1 蛇蛻中常見氨基酸組成

對比三種蛇蛻中常見氨基酸的含量，發現僅組氨酸含量存在差異，其中尖吻蝮蛇蛇蛻中組氨酸含量最高超過1%，中華眼鏡蛇含量最低僅為0.662%。

2.2 酸解、堿解效率比對實驗

蛇蛻體積大、質量輕，在本研究中采用1：100質量體積比，分別用不同乙酸、NaOH在不同溫度下水解不同時間。水解結束后對比分析不同條件水解產物中氨基酸（表1）和蛋白質（圖1）的含量。

2.3 氧化還原水解效率對比實驗

分別用1%、2%、4%、6%和8%的過硫酸氫鉀溶液水解蛇蛻60min后的殘渣用蒸餾水洗凈，再用1M尿素和1.25M亞硫酸氫鈉混合液繼續水解，稱重計算水解效率分別為50.2±2.82%、53.8±2.33%、71.7±2.64%、86.9±0.71%和53.8±1.23%。以水解產物中的蛋白質含量計算得水解效率分別為0.42±0.019、0.45±0.017、0.57±0.011、0.73±0.009、0.44±0.012g/g蛇蛻。

2.4 水解產物分子量

HPLC分析11種已知分子量的蛋白標準品，相同條件下分析2.5M乙酸（圖2A）和氧化還原二步法（圖2B）處理的蛇蛻水解物。HPLC分析顯示，酸水解和氧化還原二步法水解得到的多肽保留時間為11.70min，根據校準曲線判斷該多肽分子量為1kDa。

2.5 蛇蛻水解產物對細胞增殖的影響

蛇蛻水解液包被的96孔板培養的HaCaT細胞，測得各組細胞培養液中LDH活性物無明顯變化。細胞計數發現，8、1.6μg/mL蛇蛻溶液能促進該細胞的分裂增殖（圖3）。

3 結束語

本實驗對比酸、堿、氧化還原二步法水解蛇蛻；氧化還原法的提取效率最高，酸解蛇蛻的效率高于堿水解，水解后產物為分子量月1kDa的小肽。本實驗比較不同濃度和溫度下的酸解效果，證實溫度、濃度均對酸解效果有很大的影響。這一結果與林琳[7]、許慶陵[8]等人的研究結果相似，而堿水解似乎更多的受溫度影響。此外，本研究中還優化了氧化還原法水解蛇蛻中過硫酸鉀的濃度。

目前，膠原蛋白在很多領域都有重要的作用，如可以通過注射增強動物體內體外成骨的作用[9]，促進鼠坐骨神經的再生[10]，嵌入軟骨細胞的膠原蛋白凝膠可以修復軟骨的缺陷[11]，在體外膠原蛋白能夠促進上皮、內皮和角膜細胞的增殖[12]。本研究中獲得的蛇蛻多肽也有促進細胞增殖的生物活性。相信伴隨著科學技術的發展，膠原蛋白的生物學功能將進一步被開發利用，膠原蛋白的提取工藝也將會不斷的優化和利用。

參考文獻：

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