高粱愈傷組織培養(yǎng)研究

郭曉麗

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系 河北 衡水 053000）

高粱，屬禾本科高粱屬，是一種抗逆能力較強的作物，具有產(chǎn)量高、低耗水、耐鹽堿等優(yōu)良特性[1]。同時，還可廣泛應(yīng)用于工業(yè)開發(fā)加工領(lǐng)域，如工業(yè)發(fā)酵、生物能源等方面，具有舉足輕重的地位[2]。與其他植物相比，高粱通過組織培養(yǎng)獲得再生植株相對更難。高粱組織培養(yǎng)開始于30年前，但是通過幼胚培養(yǎng)獲得植株還是20世紀(jì)80年代的事。依據(jù)以往的研究成果，不同基因型高粱愈傷組織的誘導(dǎo)率存在差異，且親本與其雜交種的誘導(dǎo)率有一定的相關(guān)性[3]。不同外植體的誘導(dǎo)率差異較大，其中幼穗誘導(dǎo)率最高，花藥誘導(dǎo)率最低，繼代和幼苗分化都較難[4,5]。本研究以不同高粱品種的成熟種子和成熟胚為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的2,4-D，以期獲得狀態(tài)較好的愈傷組織，為進一步獲得再生植株及進行轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料。供試的兩個高粱品種河農(nóng)16和CJK1，由中科院遺傳所提供。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加適量的脯氨酸、水解酪蛋白、谷氨酰氨和蔗糖。其中6-BA 0.5 mg/L、2,4-D分別為2 mg/L、3 mg/L、4 m g/L。將配制好的培養(yǎng)液pH值調(diào)節(jié)到5.8備用。

1.2.2 高粱種子的消毒。成熟種子依次用70%乙醇消毒30 s，0.1%升汞浸泡15 min，無菌水沖洗3～5次，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.2.3 種胚的剝?nèi)　⒊墒旆N子表面消毒后浸泡12 h，無菌操作取出成熟胚，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。置于25±1℃暗培養(yǎng)。幾天后種胚膨大并產(chǎn)生愈傷組織。

1.2.4 統(tǒng)計分析。接種后統(tǒng)計不同品種不同激素濃度的接種數(shù)，待3周左右統(tǒng)計愈傷組織的塊數(shù)，計算愈傷組織出愈率。

出愈率＝誘導(dǎo)具分化能力的愈傷組織個數(shù)/接種的外植體個數(shù)×100%

2 結(jié)果及分析

2.1 不同濃度2,4-D對高粱成熟種子愈傷組織出愈率的影響。培養(yǎng)基中添加不同濃度2,4-D對不同高粱種子出愈率有一定影響。由表1可以看出，品種河農(nóng)16當(dāng)2,4-D濃度為2 mg/L時，出愈率達(dá)到最高，為89%；而當(dāng)濃度為4 mg/L時，其出愈率最低，為76%，其出愈率隨著2,4-D濃度的升高而降低。品種CKJ1當(dāng)2,4-D濃度為3 mg/L時，其成熟種子出愈率達(dá)到最高，為87%；2,4-D濃度為4 mg/L時出愈率最低，為81%。由此可知，2,4-D最適濃度在3 mg/L左右，出愈率隨2,4-D濃度的升高而呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。

表1 不同濃度2，4-D對成熟種子愈傷組織出愈率的影響

2.2 不同濃度2,4-D對高粱成熟胚愈傷組織出愈率的影響。由表2可知，品種河農(nóng)16成熟胚在2,4-D濃度為4 mg/L時，出愈率達(dá)到最高，為99%，當(dāng)2,4-D濃度為3 mg/L時，出愈率最低，為93%，但隨著2,4-D濃度的繼續(xù)降低，出愈率又出現(xiàn)上升。對于品種CKJ1來說，當(dāng)2,4-D濃度為2 mg/L時，出愈率最高，為99%，隨著2,4-D濃度的升高，其出愈率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。

表2 不同濃度2，4-D對高粱成熟胚愈傷組織出愈率的影響

3 小結(jié)

3.1 激素2,4-D對同一品種不同部位愈傷組織的影響。對于高粱品種河農(nóng)16，接種胚時，其出愈率隨著2,4-D濃度的升高呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢；接種種子時，其出愈率隨著2,4-D濃度的升高呈現(xiàn)出逐步下降的趨勢。而高粱品種CKJ1，接種胚時，其出愈率隨著2,4-D濃度的升高呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢；接種種子時，其出愈率隨著2,4-D濃度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。二者對2,4-D濃度的需求有非常大的差異，在接種胚的出愈率高的情況下，接種種子的出愈率就非常低。由以上結(jié)果可以看出，高粱愈傷組織的出愈率與所選用的部位有關(guān)。

3.2 激素2,4-D對不同品種的相同部位愈傷組織的影響。當(dāng)同時接種胚時，對于品種河農(nóng)16和CKJ1來講，出愈率均隨著2,4-D濃度的升高呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢。當(dāng)接種種子時，品種河農(nóng)16出愈率隨著2,4-D濃度的升高呈現(xiàn)出逐步下降的趨勢，品種CKJ1出愈率隨著2,4-D濃度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。二者對于2,4-D濃度的需求有較大的差異，品種CKJ1的最適2,4-D濃度略高于品種河農(nóng)16。由以上結(jié)果可以看出，高粱愈傷組織的出愈率與所選用的高粱品種有關(guān)，即與高粱的基因型有關(guān)。

4 討論

影響愈傷組織形成的因素包括材料的基因型、基本培養(yǎng)基、激素配比、培養(yǎng)基附加成分、外植體發(fā)育程度和生理狀態(tài)等，這些因素協(xié)調(diào)配合才能構(gòu)成誘導(dǎo)愈傷組織的決定條件。一般認(rèn)為，愈傷組織的發(fā)生率與品種的基因型密切相關(guān)，有些品種有很高的誘導(dǎo)率，有些卻很難誘導(dǎo)出愈傷組織。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，不同品種的高粱在相同的激素濃度下均表現(xiàn)出不同的出愈率，表明基因型對品種的再生起到很關(guān)鍵的作用[6]。

此外，在植物的組織培養(yǎng)過程中，添加適當(dāng)?shù)闹参锛に厥浅晒φT導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵因素[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在含有不同濃度2,4-D的培養(yǎng)基中，不論是高粱成熟種子還是成熟胚，均可獲得一定的愈傷組織，但是隨濃度的改變均可不同程度影響愈傷組織的出愈率。

組織培養(yǎng)中，分化能力不強的愈傷組織容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。引起褐變的原因有很多，在禾本科植物體的體細(xì)胞中含有很多酚類化合物，酚類化合物與多酚氧化酶分隔存在，此時比較穩(wěn)定。酚類經(jīng)氧化后轉(zhuǎn)化為醌類物質(zhì)最終導(dǎo)致愈傷組織死亡。可采用不同方法降低愈傷組織的褐化現(xiàn)象[8]。