醛糖還原酶AKR1B1與肺癌的相關性研究

孫基豐，孫婷婷，李超，金秀妍，張昊

（長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

醛糖還原酶AKR1B1蛋白（Aldehyde Reductase，AR）是醛酮還原酶（AKRs）超家族中的重要成員之一。它是NADPH依賴型的多功能酶類，蛋白的空間結構為一條含有巰基的單鏈的多肽，一般以單體的形式存在于生物體內[1-3]。醛糖還原酶（AKRs）超家族的許多成員都與人類的各種腫瘤疾病的發生發展密切相關。因此，醛糖還原酶超家族中的許多成員已經被作為腫瘤的診斷標志物被用于癌癥的檢測。還有一些成員是癌癥潛在的診斷標志物，是目前科學界研究的熱點[4]。

最近Ravinder等[5]發現：將醛糖還原酶小干擾RNA轉入人大腸癌細胞能夠抑制癌細胞的生長，表明醛糖還原酶可能在促進癌細胞生長中起重要作用；而在腎上腺皮質癌時醛糖還原酶表達下調，可以作為腎上腺癌的候選診斷標志物[6]。還有研究表明抑制醛糖還原酶可以抑制腫瘤壞死因子α（TNFα）誘導的血管平滑肌細胞的增殖，激活核轉錄因子κB可能是其機制之一[7]，因為醛糖還原酶參與血管平滑肌細胞增殖，可能參與血管重塑[8]。醛糖還原酶除了促進血管平滑肌細胞增殖外，還可以促進腎臟系膜細胞的增殖[9]，醛糖還原酶抑制劑能改善內皮細胞功能[10]。越來越多的證據表明：多種存在氧化應激的心血管疾病如動脈粥樣硬化、心肌缺血、血管再狹窄、心力衰竭和血管炎等都有醛糖還原酶的參與[11-15]。醛糖還原酶AKR1B1的活性還與糖尿病并發癥包括白內障[16]、視網膜病變[17]、神經病變[18]和腎病[19]存在因果關系。而糖尿病的多種慢性并發癥被認為是糖尿病致死、致殘的主要原因。

本文主要對人源醛糖還原酶AKR1B1進行密碼子優化，使其在原核大腸桿菌中表達。制備醛糖還原酶AKR1B1多克隆抗體，建立ELISA方法，繪制標準曲線。利用實時熒光定量PCR技術和ELISA檢測技術，在分子和蛋白水平上對AKR1B1蛋白在肺細胞MRC-5和肺癌細胞A549表達進行檢測與比較分析。為進一步探索AKR1B1在人類肺癌中的發生發展提供理論基礎。

1 實驗材料

1.1 質粒菌種及細胞

質粒 AKR1B1-pET15b、菌種 E.coli DH5α和BL21（DE3）、MRC-5肺細胞、A549肺癌細胞由本實驗室保存。

1.2 實驗動物

清潔級BALB/c小鼠（18-22g，4周齡，雌性，5只）從長春市億斯實驗動物技術有限公司購入。

1.3 實驗試劑

BCA蛋白定量試劑盒、細胞總蛋白提取試劑、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；（去基因組）cDNA第一連合成試劑盒、總蛋白提取試劑盒（離心柱型）、SuperReal熒光定量預混試劑增強版（SYBR Green）均購自北京天根生化科技有限公司，其他藥品均為分析純。

2 實驗方法

2.1 重組蛋白的預表達及可溶蛋白制備

將重組質粒pET-AKR1B1和pET 15b空載體分別誘導表達，37℃溫度，OD600為0.6時，IPTG誘導5h，總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。蛋白表達條件進行優化，在最佳條件下大量培養重組菌，并進行目的蛋白組氨酸柱純化，收集可溶性人醛糖還原酶AKR1B1蛋白，利用考馬斯亮藍G250法測定目的蛋白含量。

2.2 AKR1B1蛋白多克隆抗體的制備及ELISA檢測

在第一次免疫小鼠之前，對小鼠斷尾取血，低溫離心收集血清，作為陰性血清備用。利用制備的人醛糖還原酶AKR1B1蛋白腹腔注射免疫4只BALB/c小鼠，每周免疫1次，共免疫3次。最后一次免疫一周后，摘除小鼠眼球取血，室溫放置2-3h，低溫離心分離血清，間接ELISA方法測定抗體效價，-80℃儲存備用。

2.3 肺細胞及肺癌細胞培養及BCA法檢測

將培養制備好的實驗用細胞，使用PBS沖洗細胞，放入5-7倍的萃取試劑，并進行多次的吹吸混勻。10000-14000rpm離心10min取上清。配制BCA工作液。抽取試劑標準稀釋液和未知的樣液150μL至孔板上。在各個孔中滴入150μL的BCA，充分混合，置于37℃培養箱中培養2h。使用酶標儀測量562nm下的OD數值，取平均數計算濃度。

2.4 AKR1B1在細胞中mRNA水平的鑒定

選取對數生長期的細胞進行培養，使用天根公司的總mRNA提取試劑盒提取總mRMA，電泳鑒定。借助FastQuant系列的cDNA第一鏈合成試劑盒，進行總RNA反轉錄實驗。

3 結果與分析

3.1 重組蛋白的預表達及條件優化結果

3.1.1 表達載體的鑒定

對重組表達菌株AKR1B1-pET-15b-BL21（DE3）構建成功后，提取質粒DNA，進行一步電泳鑒定，結果表明重組質粒條帶明顯高于對照質粒大小如圖1所示（2-10泳道）；進一步雙酶切鑒定，結果表明重組質粒含有目的基因，大小在1000bp左右，如圖2所示（2泳道）。

圖1 AKR1B1-pET-15b一步鑒定圖1：pET-15b質粒；2-10：AKR1B1-pET-15b；11：DNA Marker DL15000

圖2 酶切鑒定圖

3.1.2 重組蛋白預表達

對誘導表達后的總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測分析，如圖3所示，通過重組菌株AKR1B1-pET-15b-BL21（DE3）表達結果與空菌pET-15b-BL21（DE3）表達結果對比發現，在大約35.4KDa位置處，重組菌株總蛋白條帶中有一條清晰的蛋白條帶，成功表達了目的蛋白人醛糖還原酶AKR1B1（2-3泳道）。

圖3 人醛糖還原酶AK蛋白預表達圖

3.1.3 人醛糖還原酶AKR1B1蛋白表達條件的優化結果

經過優化的重組蛋白表達條件為：IPTG誘導劑濃度為：1.0mmol/L，誘導表達溫度為：16℃，誘導時間為：24小時，培養箱轉速為：110rpm。在最優條件下，上清中可溶蛋白表達最好，通過Ni-NTA親和層析柱純化，蛋白電泳結果顯示目的蛋白在大約35.4KDa處。

圖4 1：低分子量標準蛋白質marker 2，3：人醛糖還原酶AK蛋白

3.1.4 AKR1B1重組蛋白濃度的測定

利用考馬斯亮蘭G-250法測定目的蛋白濃度，標準曲線為y=8.9929X+0.0269，R2=0.9914，測得目的蛋白的OD595nm值為0.367，蛋白含量為1.9mg/ml，如圖5所示。

圖5 考馬斯亮藍50法測蛋白含量建立標準曲線圖

3.2 AKR1B1蛋白鼠多克隆體效價及最佳稀釋倍數

血清效價測定結果如下表1所示：抗體最高效價為32000。

表1 血清效價測定數據

3.3 BCA法定量檢測細胞中總蛋白含量

BCA法標準曲線為y=0.0003X+0.0924，R2=0.9962如圖6所示，由BCA試劑盒測得提取的蛋白在稀釋10倍的情況下，人肺細胞MRC-5 OD值為0.124，人肺癌細胞A549為OD值0.132。由標準曲線計算得到人肺細胞MRC-5的蛋白含量為1053μg/ml，人肺癌細胞A549蛋白含量為1320μg/ml。兩種細胞表達量看，人肺癌細胞A549的目的蛋白表達量遠大于人肺細胞MRC-5的蛋白表達。

圖6 BCA法定量檢測細胞總蛋白含量標準曲線

3.4 兩種細胞中目的蛋白含量測定

用原核表達的人醛糖還原酶AKR1B1蛋白為抗原建立了ELISA標準曲線，該標準曲線y=0.1811ln(x)-0.2817，R2=0.9715，如圖7所示：

圖7 標準曲線

（2）兩種細胞中人醛糖還原酶AKR1B1含量對比如圖8所示，人肺細胞MRC-5和人肺癌細胞A549中目的蛋白含量分別為：0.82μg/mg，2.41μg/mg，實驗結果顯示人肺癌細胞A549中目的蛋白的含量約為人肺細胞MRC-5中的3倍。

圖8 兩種細胞中目的蛋白含量對比

3.5 cDNA鑒定結果

分別以MRC-5細胞和A549細胞的cDNA為模板，利用普通PCR反應對設計的AKR1B1引物的特異性進行驗證，結果如圖所示，PCR條帶單一且均在實驗預期的大小范圍之內，說明AKR1B1的引物特異性達到實驗要求，可用于實時熒光定量PCR實驗。

圖9 AK引物特異性驗證：1；DNA Marker D000 2-3；49細胞cDNA PCR結果4-5：MRC-5細胞cDNA PCR結果

3.6 實時熒光定量PCR結果

實時熒光定量PCR的檢測結果如圖11和圖12所示，圖10是目標基因的擴增曲線，圖11是溶解曲線。顯示：在PCR過程中未發生非特異性擴增，實時熒光定量PCR的結果可信。

圖10 實時熒光定量PCR擴增曲線圖

圖11 實時熒光定量PCR溶解曲線圖

運用2-△△CT的數據分析方法對獲得的實驗數據進行處理，結果如表2所示。以MRC-5細胞中AKR1B1的表達量為參照因子，A549細胞中目的蛋白含量為MRC-5細胞中的4.1倍。

表2 實驗數據處理結果

4 討論

本文成功構建了AKR1B1-pET-15b-BL21（DE3）重組表達菌株，表達條件（IPTG濃度、誘導時間、誘導溫度）進行了優化，當IPTG濃度為1mmol/L，誘導時間為24h，誘導溫度為16℃，可溶性蛋白表達最好。

利用原核表達得到的人醛糖還原酶AKR1B1蛋白免疫小鼠，獲得了多克隆抗體，抗體效價為1∶32000。

本文成功在體外培養了人肺細胞MRC-5，人肺癌細胞A549。通過間接ELISA實驗在蛋白水平上對人醛糖還原酶AKR1B1蛋白在兩種細胞中的表達進行了檢測分析。結果顯示：人肺細胞MRC-5和人肺癌細胞A549中AKR1B1蛋白的濃度 分 別 為 0.81μg/mg，2.41μg/mg。 人肺 癌細 胞A549中AKR1B1蛋白的含量約為人肺細胞MRC-5中的3倍。

通過實時熒光定量PCR試驗，結果顯示，在mRNA水平上人肺癌細胞A549中AKR1B1的含量為人肺細胞MRC-5中的4.1倍。

本文通過間接ELISA實驗和實時熒光定量PCR實驗結果分析看，人醛糖還原酶AKR1B1蛋白在肺癌中確實存在過度表達，這提示我們，人醛糖還原酶AKR1B1蛋白在人類肺癌的病理過程中發揮作用。但是該酶發揮作用的機制還不清楚，是該酶代謝失調導致癌細胞的發生，還是由于癌細胞的產生導致該酶大過量表達，還有待于進一步研究。本文研究結果AKR1B1在肺癌中的作用機制提供理論及實驗技術基礎。