缺氧誘導因子抑制劑對去卵巢大鼠骨質疏松癥治療效果的研究

張文韜 陳勛 宋濤 杜曉龍 喻姿瑞

西安市紅會醫(yī)院骨顯微修復外科,陜西 西安 710054

骨質疏松癥是一種骨代謝疾病，其特征為骨量減少，骨微結構惡化和骨折風險增加，破骨細胞的骨吸收超過成骨細胞的骨形成[1-2]。由于亞洲人口的體重指數(shù)較低，身高較矮，缺乏體力活動和低膳食鈣攝入量，因此東方人出現(xiàn)骨質疏松癥更為普遍[3]。隨著抗吸收或合成代謝治療藥物研究的進展，大量的研究探索了骨質疏松癥的科學發(fā)病機制和治療骨質疏松癥的治療選擇，但骨質疏松癥的潛在機制和治療仍有待闡明[4]。充足的氧氣和營養(yǎng)物質對細胞存活和新陳代謝至關重要。缺氧在細胞生長抑制，氧化應激和凋亡中起著重要的作用[5]。缺氧可以抑制大鼠成骨細胞的骨形成能力，生長和分化[6]。低氧誘導因子是細胞對缺氧反應的主要調(diào)節(jié)劑，許多研究已經(jīng)證明[7]低氧誘導因子水平降低能促進多能人類間充質基質細胞的募集和分化。此外，較低水平的低氧誘導因子可以通過在軟骨內(nèi)骨化中激活血管內(nèi)皮生長因子來引起增強的骨重建[8]。因此，是否可以通過抑制低氧誘導因子介導的骨形成受限來治療骨質疏松癥？本研究將探討缺氧誘導因子抑制劑[3-(5-羥基甲基-2-呋喃基)-1-苯基吲哚，QF-1]對骨質疏松大鼠的影響，驗證這種方案的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗使用16周齡雌性Sprague-Dawley大鼠(購自上海實驗動物中心)，體重245～278 g。動物喂食商品實驗室食物。測試期間保持溫度恒定為25 ℃，濕度恒定為(50±20)%，允許大鼠自由接近蒸餾水。將大鼠分成3組，每組10只。QF-1 (純度98.00%)購自Sigma(St.Louis，MO)。

1.2 模型建立和治療

適應7 d后，對大鼠進行卵巢切除術(n=20)和假手術(n=10)。10只大鼠接受假性卵巢切除術，作為對照組確定是否成功建立骨質疏松癥模型。其余20只在戊巴比妥鈉麻醉下行雙側卵巢切除手術。去卵巢大鼠隨機分為Sham組，QF-1組，OVX組。測量每組的每日食物攝入量，并且每周稱量這些大鼠。在去卵巢后為QF-1組立即皮下注射QF-1[2.5 mg (kg·d)]，持續(xù)8周。

1.3 標本收集和生化評估

治療8周后，在過量的異氟烷下處死大鼠。通過腹主動脈取血，離心獲取血清進行生化指標分析，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(北京北方生物技術公司)測定血清I型前膠原氨基末端前肽(PINP)和Ⅰ型膠原羧基端肽(CTX-I)濃度。

1.4 Micro-CT檢測

采用Micro-CT(SkyScan 1174,Aartselaar，比利時)檢測大鼠右側脛骨。評估在近側生長板下方1 mm處選擇的3 mm厚的感興趣的體積(VOI)。 Micro-CT參數(shù)：管電壓50 kV；管電流：0.1mA；切片厚度：15 mm；像素尺寸：15 mm。 檢測骨體積分數(shù)(bone volume ratio,BV/TV)，骨密度(bone mineral density,BMD)，骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)。

1.5 生物力學評估

取大鼠右側股骨，將其置于MTS-858型生物力學實驗機上，支點跨距17 mm，中點為加壓點，加載速度為 2 mm/min，計算機記錄載荷-位移曲線，從載荷-變形曲線計算極限載荷(N)，能量(J)和剛度(N/mm)。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 去卵巢手術對大鼠骨密度影響

來自Sham和OVX組的大鼠股骨干骺端的BMD為(230.32±29.23)mg/cm2和(184.45±26.95)mg/cm2。在定量分析中，來自Sham組的大鼠股骨干骺端的BMD比OVX大鼠的高27.3%。這些數(shù)據(jù)證實我們實驗中OVX大鼠骨質疏松癥的建立是成功的。

2.2 Micro-CT檢測結果

治療8周大鼠的脛骨Mciro-CT掃描結果如圖1所示，微觀參數(shù)如圖2所示。與OVX組相比，QF-1組和Sham組的股骨遠端骨量和小梁厚度顯著增加(P<0.05)；而OVX組的小梁間距增加(P<0.05)。但在QF-1組和Sham組中均降低(P<0.05)。骨組織形態(tài)計量學參數(shù)顯示，QF-1對去卵巢大鼠脛骨骨量和骨密度起保護作用。

圖1 治療8周后大鼠脛骨Micro-CT掃描結果Fig.1 Micro-CT scans of tibia in rats after 8 weeks treatment

圖2 治療8周后大鼠脛骨微觀參數(shù)Fig.2 Microscopic parameters of tibia in rats after 8 weeks treatment

注：與OVX比較，*P<0.05；與QF-1比較，#P<0.05。

2.3 生物力學性能

生物力學測試獲得的數(shù)據(jù)見圖3，Sham組具有最高的極限載荷，能量和剛度；與OVX組比較，QF-1組極限載荷，能量和剛度明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 治療對大鼠股骨生物力學的影響Fig.3 Effects of treatment on femur biomechanics

注：與OVX比較，*P<0.05；與QF-1比較，#P<0.05。

2.4 治療后大鼠血清CTX-I和PINP的影響

治療后大鼠血清CTX-I和PINP如圖4所示，與Sham組比較，OVX和QF-1組的CTX-I和PINP顯著增加(P<0.05)。 QF-1組的CTX-I和PINP較OVX組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 治療對大鼠血清CTX-I和PINP的影響Fig.4 Effects of treatment on serum CTX-I and PINP

注：與Sham比較，*P<0.05；與OVX比較，#P<0.05。

3 討論

骨質疏松癥是一種全身代謝性疾病，其特征為骨質疏松，骨結構細微破壞，骨強度降低和骨折風險增加。骨質疏松癥可分為兩類：原發(fā)性和繼發(fā)性。在臨床上，原發(fā)性骨質疏松癥可能是絕經(jīng)后婦女體內(nèi)激素缺乏的結果，它可以表現(xiàn)為老年性骨質疏松癥本身，由許多因素引起，或者可以將其歸類為特發(fā)性。繼發(fā)性骨質疏松癥主要是由以下一種或多種原因造成的：內(nèi)分泌因素，過量使用激素藥物，營養(yǎng)不足，疾病或其他原因，如日光照射，吸煙，飲酒或維生素D合成問題。考慮到病情發(fā)展和當前狀況，骨質疏松癥已經(jīng)成為重要的公共衛(wèi)生問題之一。本研究中，在雌激素缺乏誘導的骨質疏松癥的大鼠模型中測試QF-1的功效，并檢查骨重建中的調(diào)節(jié)功能。在OVX動物中，QF-1改善了小梁骨微結構并減少了骨吸收。這些結果提供了QF-1作為新型抗吸收治療絕經(jīng)后骨質疏松癥的有力證據(jù)。

絕經(jīng)后骨質疏松癥的骨丟失主要是由于骨形成反應不足導致的骨吸收相對過多[9]。雌激素主要通過對破骨細胞施加直接作用來抑制骨吸收，盡管雌激素對成骨細胞/骨細胞的作用和T細胞介導的破骨細胞調(diào)節(jié)也可能起作用。生理條件下的活性基礎多細胞單位內(nèi)，在重塑周期的再吸收階段，骨被破骨細胞不斷移除。逆轉階段后，在形成期間，發(fā)生骨吸收的部位處由成骨細胞產(chǎn)生新的骨基質，其中形成的骨量等于骨再吸收的量，從而維持骨量[10-11]。正常骨形成和維持需要成骨細胞和破骨細胞活性之間的平衡。已經(jīng)描述了一種偶聯(lián)機制，其中再吸收產(chǎn)物和破骨細胞衍生因子刺激成骨細胞譜系細胞的骨形成[10]。類似地，成骨細胞譜系中的細胞調(diào)節(jié)破骨細胞形成和活性。由于重塑的耦合性質，大多數(shù)可用的抗吸收劑也直接或間接減少骨形成，限制其對骨量的作用。在本研究中，我們觀察到QF-1治療組與OVX組相比，骨量明顯增加。

此外，我們僅觀察到QF-1對成骨細胞介導的骨形成作用較小，且無顯著影響。 QF-1對骨骼的合成代謝作用是否需要進一步研究及QF-1處理的破骨細胞在骨骼重塑的逆轉階段中的作用尚待確定。各種抗吸收劑靶向破骨細胞中不同的信號通路，可能為復雜病理性骨重建階段的骨質量和質量改善提供有用的工具[10]。應特別注意用于治療絕經(jīng)后或老年性骨質疏松癥藥物的禁忌癥。QF-1通過引起破骨細胞凋亡而發(fā)揮抗骨質疏松作用[12]，因此是骨吸收的強有力抑制劑。然而，雙膦酸鹽如阿侖膦酸鈉在骨組織中的作用會持續(xù)數(shù)年，這可能導致不期望的臨床副作用，包括骨壞死和非典型骨折。

聯(lián)合治療仍然是提高骨質疏松癥患者抗骨折療效的有效方法[13]。當考慮與其他抗吸收劑和合成代謝劑的組合療法累加效應時，QF-1可能是更好的抗吸收性候選者。當然，本研究也有不足之處。首先，在本研究中，我們僅分析了QF-1在OVX誘導的骨質疏松大鼠的治療中的一個劑量和給藥途徑。盡管觀察到該劑量下QF-1的骨骼效應很明顯，但是可以通過改變藥代動力學、給藥方式或治療持續(xù)時間來進一步改善。通過Micro-CT測量，QF-1緩解并減少了OVX大鼠的骨吸收參數(shù)。通過顯微CT測量以及血清骨吸收參數(shù)顯示，QF-1可以改善OVX大鼠骨小梁的骨丟失。QF-1的抗吸收作用提示了絕經(jīng)后骨質疏松癥新的治療嘗試。