夾心ELISA法對奶牛早期妊娠的診斷及注意事項

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(1.湖南農業大學動物科技學院，長沙 410128；2.上海奶牛育種中心有限公司；3.光明牧業有限公司)

奶牛在懷孕后體內會生成一種妊娠蛋白，這種蛋白稱為妊娠特異性蛋白B(PSPB)。它是由胚胎分離得到的幾種天冬氨酸蛋白酶家族的混合物。1987年Garth.Sasser教授發現[1-2]，PSPB可用作牛羊等反芻動物早期孕檢的有效標記物，然而它只有當奶牛懷孕時才會釋放。隨著配種時間的延長，這種蛋白在體內的濃度將越來越明顯，尤其是在懷孕后的28 d至33 d，這種蛋白的濃度值達到高峰。優孕凱斯(BioPRYN)是一種使用抗原捕捉(夾心)，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測牛只血清中妊娠特異性蛋白 B(PSPB)的早期妊娠診斷技術。其原理是牛血清中的 PSPB 結合包被孔中的抗體(兔IgG 免疫血清)，用標記結合的二抗進行檢測，最后通過顏色變化與酶標儀讀數進行定量分析。夾心ELISA靈敏度高，特異性強，空懷檢出率高。根據光明牧業有限公司旗下牧場近兩年86775頭份奶牛的數據統計分析，其空懷檢出率可達99.55%。雖然空懷檢出率很高，但依然存在許多問題，采樣時間，采樣手法以及在實驗過程中操作不當等都可能造成假陽性的結果。因此本文主要介紹夾心ELISA在奶牛早期妊娠診斷中的應用及操作過程中的注意事項，為降低假陽性的風險提供理論基礎。

1 實驗前處理

1.1 樣品采集 采集配種后28 d至33 d的奶牛尾根靜脈血。采血量應控制在3～5 mL，不得少于2 mL，以防劑量不足，錯過最佳檢測時間。另外，采集完的血樣應當場貼好標簽，注明管號和牛號，放入-6℃冷藏保存，尤其夏季溫度較高，在寄送實驗室檢測前必須放入冰袋以防采集的血液變質，送檢單單獨存放隨樣品一同寄出。

1.2 樣品制備 實驗室收到血樣后，仔細核對血樣編號與送檢單，若出現樣本上的牛號與送檢單上牛號不一致，需在送檢單上用紅色水筆注明管上牛號，實驗室所有檢測牛號都以血樣牛號為準。確認無誤后將全血采血管放入3000轉速的離心機中離心5 min。取上清液1～1.5 mL到2 mL離心管(離心管由管號+牛號組成，與采血管相對應)。

2 實驗

2.1 材料與設備

2.1.1 儀器Thermo FC型號酶標儀(帶有600 nm波長濾光片)；37 ℃ 或者20 ℃恒溫箱一臺；

2.1.2 移液器50.0～200.0 μL單槍頭移液器；50.0～300.0 μL多通道移液器；及配套移液槍頭若干；

2.1.3 輔助用品封口膜若干；移液槽5～6個；吸水紙巾；

2.1.4 試劑美國“優孕凱斯”早孕診斷試劑盒；質控劑。

2.2 操作步驟

2.2.1 回溫實驗前回溫(20～25 ℃)所需的試劑盒、微孔板和樣品。使用前需將所用試劑搖勻。

2.2.2 ELSIA板操作 在所有測試孔中加入樣品緩沖液。其次加入標準品和測試樣品。標準品做重復樣，按照縱向排列的順序依次加入，第二列開始直至倒數第二列縱向依次向下加入待檢血清，最后一列留加質控樣，對比每次實驗結果的準確性。每種溶液加樣時均使用一次性清潔的槍頭，不可二次使用，避免交叉污染造成假陽性或者假陰性。加板結束用封口膜將微孔板密封以防蒸發，在20℃或37℃的培養箱孵育1 h。1 h孵育后，移去封口膜，洗板4次，在紙巾上拍干，使用多通道的移液器在所有孔中加入200 μL快速檢測液(QUICK Detector)。用封口膜蓋住板子，在室溫下(20 ℃)孵育1 h(或者37 ℃孵育30 min)。1 h后倒出結合溶液，洗板2次，在紙巾上拍干后每孔中加入200 μL的增強液(Enhancer)。用封口膜蓋住板子，20 ℃下孵育1 h(或者37 ℃孵育30 min)。

若出現加樣顏色不一致，請務必換一把多通道移液槍，這是用槍不規范造成的移液槍污染，屬人為原因，并非試劑原因。1 h后洗板4 次，加入200 μL TMB底物溶液到每個孔中。加TMB時，確保無菌，以避免剩余試劑污染導致檢測結果的準確性。另外TMB易被氧化，所以在使用前務必要避光保存。15 min孵育結束后在所有孔中加入終止液，用手輕輕地拍打微孔板的周邊，使其內容物均勻的混合在一起。加終止液的順序要與加TMB的順序一樣，保證反應時間的一致性。全部試劑加完后眼觀可以做初步的判斷，藍色為懷孕，黃色為空懷，而較淺的顏色需要讀OD值才能確定。

2.2.3 讀數與分析 在加樣后30 min內將微孔板放在600 nm左右波長的酶標儀上讀數。將酶標儀讀出OD值數據導入分析軟件COWPIE，輸入牛號(圖1)，系統會自動生成標準曲線并計算出R2值。實驗成立的條件是標準曲線R2值必需大于0.985(圖2)。生成報告前，選擇正確的Multiplier 系數：

BioPRYN QK: 大于3 h的樣品孵育，Multiplier系數

BioPRYN QK: 小于3 h的樣品孵育，Multiplier系數

此外，標準品W 的OD 值必須大于0.4 才被認為有效。

(W的OD值>X的OD值>Y的OD值>Z的OD值)R2≥0.985。

圖1 牛號輸入反饋圖

圖2 標準曲線圖

根據曲線，每個樣品的OD值會經過最小二乘法回歸(LSG)轉化成標準化的結果。離群值已經過調整成符合回歸方程的值。轉化后的結果值與已確定的臨界值進行比較(參考表1)，將每個樣品的結果進行歸類。結果以標準化的BioPRYN來顯示(圖3)。

血液早孕檢測屬于實驗室檢測，該診斷方法相比B超診斷變異小，影響因素少，不同的實驗操作人員按照操作規程進行檢測，其準確性都是一致的[3]。所以系統測出的懷孕與空懷進一步與板上的顯色反應進行核對，會發現其結果與顏色是一一對應的。若有不同，肯定是操作不慎造成，需在該牛號旁邊標注，以備下次復檢待用。

表1 標準化的OD值分類結果表

圖3 軟件分析后標準化結果圖3 實驗后處理

實驗完成后，將試劑盒放置冰箱冷藏(4～8 ℃)，切不可放置實驗臺貯存，更不能放在陽光直射的地方。特別注意的是冬天溫度較低，為避免試劑冰凍影響試劑的正常使用，需將冰箱冷藏的溫度適當調高。另外，每次實驗后都應用新潔爾滅按1∶14的比例配制消毒水對實驗操作臺進行消毒滅菌。把實驗服放消毒水中浸泡3～4 h，一個星期浸泡一次，有條件可每日浸泡，這是對環境的要求，更是為了檢測員自身及他人的生命健康。因此，做好各項消毒防范措施是每個檢測員應盡的職責。

4 小結

目前，夾心ELISA在奶牛早期妊娠診斷技術上已越來越成熟，特別是與傳統B超或直腸檢查相比，顯示出了其獨特的優勢。該項診斷技術靈敏度高，特異性強，不僅提高了繁殖率，而且也減少了牛只的應激，對空懷牛只的檢出率更是接近于100%。但在采樣和操作環節，仍然需要謹慎操作，以防不正當的行為導致實驗結果假陽性，影響配種時間。特別是假陰性，后果更是不堪設想。因此，我們必須利用好這項技術才能更好的為牧場服務。