納米細菌對腎小管上皮細胞損傷在腎結石形成中作用的研究

王議鶴，王勤章，吳 雙，申茂磊，褚 浩，錢 成，錢 彪*

泌尿系結石是泌尿外科最常見的疾病之一［1］，該病的成因非常復雜，納米細菌（nanobacteria，NB）感染被認為是結石形成的主要原因之一［2-3］，其在腎結石患者的血液、尿液和結石中的陽性檢出率均在90%以上［4-5］。NB是一種具有超微結構的人體病原菌，具有較強的感染能力，能在菌體外周形成羥磷灰石結晶外殼，黏附并損害集合管上皮細胞及腎乳頭細胞，從而形成結石［6］。

隨著醫學技術的發展，結石診療有了長足的進步，但碎石治療后患者的結石復發率仍然很高［7］。因此，探究泌尿系結石的形成機制以尋找新的治療手段是當前臨床中亟待解決的難題。四環素是為數不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一，SHOSKES等［8］研究了四環素對NB相關慢性前列腺結石患者的治療效果，其中80%患者的癥狀在治療3個月后得到了極大改善，10例患者的結石縮小50%。然而，目前并不清楚NB如何在腎結石形成過程中發揮其獨特作用。本課題旨在通過研究NB損傷人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）導致晶體滯留的機制以及四環素對這一過程的抑制作用，以期為泌尿系結石的預防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 HK-2細胞購自武漢大學保藏中心。DMEM培養基，1640培養基，胎牛血清，磷酸鹽緩沖液（PBS），HEPES緩沖液，一水草酸鈣（COM），納米級羥基磷灰石（nHAP），四環素，過氧化氫（H2O2）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、Na+/K+ATP酶試劑盒、Ca2+/Mg2+ATP酶試劑盒，phalloidin-FITC。細胞孵育箱，倒置相差顯微鏡，透射電子顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡，酶標儀。

1.2 NB培養與鑒定 于2016年10月—2017年10月在石河子大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科收集臨床確診腎結石且未應用藥物或手術治療患者的尿液，將5～10 ml尿液采用0.9%氯化鈉溶液稀釋2倍，高速離心機4 ℃離心40 min（14 000×g）；取管底2 ml混勻，以0.45 μm濾器過濾，再經0.22 μm濾器加壓過濾。將1 ml濾液注入含約4 ml DMEM培養液、10% γ-胎牛血清和1% HEPES緩沖液的細胞培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養。倒置相差顯微鏡觀察NB生長，篩選出無污染的標本，用吸管吹打混勻后，吸入EP管。14 000×g，離心20 min，棄上清液，再加入無菌注射用水1.5 ml吹打混勻。重復上述步驟共計清洗NB 3次，采用納米細菌鈣染色（Von KOSSA法）和應用透射電子顯微鏡掃描（負染法）鑒定。

1.3 實驗分組 選取生長速度正常、光鏡下未見污染、呈路石樣形態的HK-2細胞，隨機分為5組：對照組（胎牛血清、1640培養液+HK-2細胞），NB組（NB菌液、胎牛血清、1640培養液+HK-2細胞），COM組（5 mmol/L COM懸液、胎牛血清、1640培養液+HK-2細胞），nHAP組（300 mg/L nHAP、胎牛血清、1640培養液+HK-2細胞）和四環素干擾組（5 mg/L四環素、NB菌液、胎牛血清、1640培養液+HK-2細胞）。

1.4 各組細胞蘇木素-伊紅（HE）染色觀察 分別于共同培養6、12、24 h后去除12孔板的爬片，PBS沖洗3次，95%乙醇溶液固定20 min，PBS沖洗3次，Harris蘇木素染1 min，自來水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化5 s，伊紅染5 min；經梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固，于光學顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.5 各組細胞透射電子顯微鏡觀察 分別于共同培養12、24 h后提取各組細胞制成細胞懸液，離心后轉移至EP管內，PBS浸泡5 min后棄上清液；加入預冷的3%戊二醛固定2 h，PBS沖洗2次，3 min/次；再加入1%鋨酸固定2 h，PBS沖洗2次，3 min/次；梯度乙醇脫水，浸透、包埋后80 ℃聚合過夜。行超薄切片、染色。于透射電子顯微鏡下觀察細胞形態與超微結構變化。

1.6 細胞損傷因子指標檢測 分別于共同培養6、12、24 h后取各組細胞上清液，向吸盡培養液的細胞中加入0.25%胰蛋白酶并反復吹打將細胞消化，轉移至EP管中，分別加入PBS 400 μl。用超聲粉碎機粉碎，ATP酶試劑盒比色法檢測各組細胞Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性。按照試劑盒說明書分別檢測培養液中H2O2、MDA、LDH含量。

1.7 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測晶體滯留實驗 將HK-2細胞接種于鋪有清潔蓋玻片的12孔板內，分別于共同培養6、12、24 h后取出各組樣本，加入COM懸液（每孔內COM濃度200 mg/L），輕搖5～10 s，使COM晶體與底部細胞充分接觸。3 min后吸凈蓋玻片上方液體，加入飽和草酸鈉溶液漂洗3次。將蓋玻片從孔板中取出，4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗2次，5 min/次，搖床輕晃；加入5 mg/L的phalloidin-FITC 50 μl， 室 溫 避 光 孵 育 20 min；PBS沖 洗 2次，5 min/次；甘油封固。在488 nm和633 nm激發光下逐一觀察各組蓋玻片并進行圖像采集。

1.8 統計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 各組細胞形態HE染色結果（×200）Figure1 HE staining of HK-2 cells in each group

2 結果

2.1 各組細胞HE染色結果 HE染色結果顯示：對照組細胞形態大小均一，細胞核清晰、胞質致密，未見明顯異常；NB組共同培養6 h后，可見部分細胞膨脹增大，細胞核松散，核膜模糊不清；COM組細胞腫脹，形態不規整，細胞數目明顯減少，細胞核松散，部分核膜溶解，核仁消失，隨著作用時間的延長，細胞損傷逐漸加重；nHAP組僅少量細胞腫脹，核膜較清晰，細胞核更加致密；四環素干擾組大部分細胞形態規則，致密，細胞核清晰，部分細胞出現胞體膨脹，細胞核松散（見圖1，本文彩圖見本刊官網：www.chinagp.net相關文章）。

2.2 各組細胞透射電子顯微鏡觀察結果 實驗過程中，對照組細胞膜結構完整正常，膜外微絨毛數量豐富、規則；核膜結構正常；線粒體形態正常及細胞亞顯微結構正常（見圖2A、B、C和D）。

共同培養12 h后，NB組微絨毛結構稍紊亂，局部絨毛消失；細胞核畸形，染色質輕度分布不均，局部染色質凝集；核外膜局部區域降解（見圖2E）；部分線粒體結構輕度腫脹；胞質中偶見髓樣小體（見圖2F）。COM組細胞膜局部區域結構紊亂，微絨毛分布不均，局部絨毛消失；細胞核染色質邊集（見圖2I）；線粒體結構腫脹；胞質中見自噬小體。nHAP組細胞膜局部區域結構破損，微絨毛結構消失（見圖2M）；部分線粒體結構輕度腫脹；胞質中見髓樣小體（見圖2N）。四環素干擾組細胞膜結構完整，微絨毛結構稍紊亂；細胞核畸形，染色質輕度分布不均，局部染色質凝集（見圖2Q）；核外膜局部區域降解；部分線粒體結構輕度腫脹；胞質中偶見髓樣小體（見圖2R）。

共同培養24 h后，NB組細胞膜結構破損，細胞核裸露在外；微絨毛基本消失（見圖2G），線粒體數量較少，結構腫脹，線粒體嵴模糊不清；胞質中可見較多髓樣小體及自噬小體（見圖2H）。COM組細胞膜結構破損，微絨毛分布紊亂，絨毛消失；核膜階段性溶解，結構模糊不清；線粒體結構腫脹，線粒體嵴模糊不清；胞質中見髓樣小體及自噬小體（見圖2L）。nHAP組細胞膜結構完整，核膜結構正常；微絨毛分布不均，局部絨毛消失；細胞核染色質邊集（見圖2O）；線粒體結構腫脹，線粒體嵴模糊不清，局部區域降解；胞質中偶見髓樣小體及自噬小體（見圖2P）。四環素干擾組細胞膜結構完整，微絨毛基本消失；線粒體數量較少，結構腫脹，線粒體嵴模糊不清（見圖2S）。胞質中可見較多髓樣小體及自噬小體（見圖2T）。

2.3 各組細胞損傷因子指標檢測結果 共同培養6 h后，各組細胞Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；共同培養12、24 h后，各組細胞Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中NB組和COM組共同培養12、24 h后Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性均低于對照組；nHAP組共同培養12 h后Na+/K+ATP酶活性低于對照組、高于COM組，Ca2+/Mg2+ATP酶活性低于對照組；共同培養24 h后Ca2+/Mg2+ATP酶活性低于對照組，高于NB組和COM組；四環素干擾素組共同培養12、24 h后Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性均高于NB組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

圖2 透射電子顯微鏡觀察結果（A，C，E，G，I，K，M，O，Q，S：×1 700；B，D，F，H，J，L，N，P，R，T：×5 000）Figure2 Results of HK-2 cells in each group via transmission election microscope

共同培養6 h后，各組H2O2含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；共同培養12、24 h后，各組H2O2含量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中NB組和COM組共同培養12、24 h后H2O2含量均高于對照組，nHAP組共同培養24 h后H2O2含量均低于NB組和COM組，四環素干擾組共同培養12、24 h后H2O2含量均低于NB組，差異有統計學意義（P＜0.05）。共同培養6、12、24 h后，各組MDA含量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中NB組和COM組MDA含量均高于對照組，nHAP組MDA含量均低于NB組和COM組，四環素干擾組MDA含量均低于NB組，差異有統計學意義（P＜0.05）。共同培養6、12、24 h后，各組LDH含量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中COM組LDH含量均高于對照組，nHAP組和四環素干擾組共同培養6 h后LDH含量均低于NB組和COM組，共同培養12、24 h后LDH含量均低于COM組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結果 共同培養6 h后，NB組、COM組可觀察到少量晶體黏附，隨著共同培養時間延長，兩組細胞晶體黏附量進一步增加。共同培養6、12 h后，nHAP組未觀察到明顯的晶體黏附現象，共同培養24 h后，可觀察到少量晶體黏附。各時間點，四環素干擾組晶體黏附量均少于NB組（見圖3）。

表1 各組不同時間點Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比較（s，n=3）Table1 Comparison of Na+/K+ ATPase and Ca2+/Mg2+ ATPase activity among each group at different times

表1 各組不同時間點Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶活性比較（s，n=3）Table1 Comparison of Na+/K+ ATPase and Ca2+/Mg2+ ATPase activity among each group at different times

注：與對照組比較，aP＜0.05；與NB組比較，bP＜0.05；與COM組比較，cP＜0.05；NB=納米細菌，COM=一水草酸鈣，nHAP=納米級羥基磷灰石

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表2 各組不同時間點培養液H2O2、MDA和LDH含量比較（s，n=3）Table2 Comparison of H2O2，MDA and LDH contents among each group at different times

表2 各組不同時間點培養液H2O2、MDA和LDH含量比較（s，n=3）Table2 Comparison of H2O2，MDA and LDH contents among each group at different times

注：與對照組比較，aP＜0.05；與NB組比較，bP＜0.05；與COM組比較，cP＜0.05；H2O2=過氧化氫，MDA=丙二醛，LDH=乳酸脫氫酶

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3 討論

泌尿系結石的病因復雜，其涉及遺傳、環境、生活膳食習慣等多種因素［9-11］。有文獻報道，含鈣結石占泌尿系結石的大多數，且約有23.7%的患者合并高鈣尿［12］。近年來，大量文獻報道了COM對動物腎小管上皮細胞的損傷作用，細胞膜損傷會促進細胞對晶體的黏附和聚集，晶體的聚集又會加重對細胞的損傷，從而使得晶體黏附和聚集進一步加強，促進了結石的形成［13-14］。李成文等［15］研究發現，將5 mmol/L COM晶體加入Wistar大鼠腎小管上皮細胞的培養液中8 h后，可以觀察到大量晶體黏附現象發生。因此，本研究將COM組（5 mmol/L）設為陽性對照組。

圖3 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞晶體黏附情況（×200）Figure3 The crystal adhering effect observed by laser scanning confocal microscope

ANSARI等［2］在30例腎結石患者中發現27例磷酸鹽結石患者感染NB，另外3例患者并未發現感染NB，NB的生物礦化能力可能與機體結石等鈣化相關疾病有關。ABROL等［4］指出NB在誘導鈣化和結石形成過程中起到了非常關鍵的作用。MARTEL等［16］認為NB廣泛存在于人體血液、尿液及組織器官中，NB可導致泌尿系結石形成。褚浩等［17］通過給大鼠一次性尾靜脈注射NB懸液，采用微計算機斷層掃描技術（Mirco CT）和病理組織學檢查發現NB在第4周開始誘導大鼠腎臟形成結晶，說明NB可通過早期損傷腎臟誘導結晶形成。NB可形成磷酸鈣外殼，該外殼成分與nHAP相似。nHAP是一種與人體硬組織無機成分相類似的生物活性材料，在替代骨組織方面具有很大的應用潛力，但過高濃度的nHAP（200 mg/L以上）會對細胞DNA及大分子物質造成不可逆轉的損傷，最終導致細胞凋亡［18］。本研究設置了高濃度nHAP組（300 mg/L）與NB組進行各項細胞損傷因子指標的比較。通過HE染色和透射電子顯微鏡對細胞進行形態學觀察，檢測ATP酶活性及培養液中LDH含量評估細胞膜損傷程度，檢測H2O2和MDA含量確定損傷過程中有無脂質過氧化反應的參與。

本研究結果提示，COM對細胞膜的損傷較大，培養液中LDH含量升高和ATP酶活性降低說明細胞膜的完整性和連續性受到了較大影響；隨著COM作用時間的推移，胞質中線粒體腫脹加重，細胞核逐漸溶解消失。NB和nHAP對細胞的損傷程度也隨著作用時間的延長而加重，但主要表現為刷狀緣排列紊亂，細胞膜則較完整。HE染色結果顯示，與nHAP組和四環素干擾組相比，在NB組細胞中觀察到了更多的胞體腫脹、核膜溶解、核仁消失等現象。通過透射電子顯微鏡觀察及細胞損傷因子指標檢測發現，nHAP在HK-2細胞中的分布密度比NB高，但對細胞的損傷程度卻低于NB。損傷HK-2細胞后，NB組中細胞晶體黏附程度遠高于nHAP組和四環素干擾組。綜合以上結果表明，NB對HK-2細胞的損傷程度及晶體滯留的影響遠大于nHAP，四環素可以抑制NB在這一過程中的作用，提示在損傷HK-2細胞及后續晶體黏附的過程中起主導作用的可能并非NB的磷酸鈣外殼，而是其菌體本身。

細胞損傷是引起結石的關鍵因素，腎小管上皮細胞損傷脫落后暴露的基底膜可以吸引結晶的黏附，而壞死的細胞碎片會進一步富集參與形成結石，從而導致腎結石的發生、發展［19-20］。HONG等［21］發現NB可以誘導HK-2細胞脂質過氧化，導致HK-2細胞黏附COM晶體，進而損傷腎小管上皮細胞，這可能與腎結石的形成有關。有文獻報道，COM晶體通過誘發脂質過氧化反應產生大量活性氧自由基對腎小管上皮細胞造成損傷［22］。THAMILSELVAN等［23］將 LLC-PK1細胞置于500 g/L COM晶體條件下培養4 h后，觀察到培養液中LDH和MDA含量升高，而一定濃度范圍內的抗氧化劑可以有效抑制脂質過氧化反應，從而減少活性氧對細胞的損傷。本研究中，在COM和NB損傷細胞的過程中均伴有H2O2和MDA含量的升高，nHAP組中MDA和H2O2含量無明顯升高，四環素干擾組MDA和H2O2含量低于NB組，提示脂質過氧化反應是NB損傷HK-2細胞的機制之一，且四環素可以抑制這一過程。

四環素是為數不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一，其可以穿透NB的鈣質外殼從而發揮抗菌作用［19，24］。有文獻報道，四環素在治療NB相關的慢性前列腺、間質性膀胱炎、牙周疾病和牙結石等方面均取得了不錯的效果［25-26］。HU等［5］通過尾靜脈注射NB建立大鼠腎結石模型，發現四環素灌胃可以減少大鼠24 h尿LDH以及腎小管結晶數，推測四環素可能有抑制腎結石形成的作用。但目前為止，尚缺乏相關體外實驗的證據。本研究通過體外共同培養NB和HK-2細胞，發現四環素可以抑制NB對HK-2細胞的損傷并減少損傷后的晶體滯留。進一步確認四環素在腎結石的預防和治療方面的有效性，對于該病在臨床上的診治具有積極的意義。

綜上所述，NB可能通過誘導脂質氧化反應損傷HK-2細胞，損傷程度和晶體滯留程度與NB作用時間呈正比，四環素可以抑制這一過程。因此，NB可能通過以下途徑導致腎結石的形成：NB感染損傷腎小管上皮細胞后，晶體向暴露的基底膜黏附，與NB和壞死細胞碎片共同形成結石。因此運用四環素或其他抗菌藥物殺滅NB或者抑制脂質過氧化反應可能是預防和治療結石的一個新的方向。

作者貢獻：王議鶴、吳雙、錢彪進行文章的構思與設計：王議鶴、申茂磊進行研究的實施與可行性分析，撰寫論文，對文章整體負責，監督管理；王議鶴、吳雙、申茂磊、褚浩負責數據收集；王議鶴進行數據整理、統計學處理、論文修訂；王議鶴、王勤章、褚浩、錢成、錢彪進行結果的分析與解釋；王勤章負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。