煙葉陳化過程細菌群落演替特征

周家喜,喻理飛,張 健,張曉敏,胡大鳴,歐明毅,鄒 曉,*

1 貴州大學生命科學學院 生態系,貴陽 550025 2 貴州中煙工業有限責任公司,貴陽 550001

煙葉陳化是指在人工可控的倉儲環境下煙葉與微生物及環境相互作用的發酵過程,在此過程中,倉儲環境因子(溫度、濕度等)、煙葉化學組分(總糖、蛋白質、淀粉、生物酶等)含量、煙葉水分及酸堿度等與煙葉表面微生物彼此聯系、互相促進、互相制約共同構成了煙葉陳化的特定生態系統,并在物質流、能量流和基因流“三流運轉”規律的交互作用下構成了煙葉微生態的動態發展和特定階段的動態平衡[1]。環境信息的傳遞和煙葉化學物質的改變直接或間接的影響著煙葉微生物的種類和數量及代謝產物的產生與積累,并最終決定著物質和能量的走向[2-3],因此,研究倉儲生態因子和煙葉化學成分的改變對煙葉微生物群落結構和功能的影響具有重要意義。隨著煙葉陳化的不斷進行,微生物群落的消長演替又會引起煙葉組分微環境的變化[4],如蛋白質、淀粉、糖類、纖維素等大分子物質降解[5-6]及紫羅蘭酮、大馬酮、糠醛等小分子物質產生[7-8]。環境因子變化也會作用于微生物,并導致群落結構及代謝產物的成分和比例發生變化,最終形成產品特有的生態風味[9],所以,研究微生物群落動態變化對了解煙葉陳化生態系統的運行很有必要。

煙葉陳化過程中占優勢的微生物群落以細菌類為主[10],但是目前90%—99%的微生物處于不可培養狀態[11],因此本研究依托二代測序的技術優勢[12]對樣品中微生物菌群進行分析,同時結合分析陳化過程中煙葉化學組分的變化,揭示細菌群落變化過程與煙葉化學組分之間作用規律,加深對煙葉陳化機制的理解。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：分別陳化了0、6、12、18、24個月的云南保山C3F煙葉樣品(產地：云南保山地區；品種：云87；等級：C3F)；采集地：貴陽庫(GY)、壇廠庫(TC)、紫云庫(ZY)；采集方式：除去煙箱表層煙葉,按五點式收集煙葉樣品,500g,存于-20℃冰箱中,各庫樣品同一時間內采集；采集時間：2014年7月、2015年1月、2015年7月、2016年1月、2016年7月；編號：GY-0、TC-0、ZY-0、GY- 6、TC- 6、ZY- 6、GY- 12、TC- 12、ZY- 12、GY- 18、TC- 18、ZY- 18、GY- 24、TC- 24、ZY- 24。

1.2 方法

1.2.1 煙葉微生物收集與總DNA提取

參照Zhao等[13]和Su等[14]的網膜法收集煙葉總微生物。稱取60g煙葉樣品,剪碎,平均分成3份,分別置于3個裝有200mL pH=7.0磷酸緩沖溶液(PBS)的三角瓶中,27℃、200r/min震蕩培養1h；用已滅菌的雙層紗布過濾培養物,收集濾液；6000r/min室溫離心30min,收集沉淀；加入20mL PBS緩沖液,重新制成菌懸液,6000r/min離心,收集沉淀,最后將相同樣品的沉淀物匯集到一起,即為煙葉總微生物。參照OMEGA公司E.Z.N.A.? SoiL DNA Kit試劑盒說明方法提取微生物總DNA。提取的總DNA送北京諾和致源科技股份有限公司進行高通量測序。

1.2.2 PCR擴增及高通量測序

選取16S rRNA基因 V4片段進行PCR擴增,擴增產物使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。選用引物：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。反應體系(30μL)：Phusion Master Mix(2×) 15μL；Primer1(2μmol/L)1.5μL；Primer2(2μmol/L)1.5μL；DNA模板(1ng/μL)10μL；H2O 2μL。反應程序：98℃預變性1min；98℃ 10s,50℃ 30s,72℃ 5min,共30個循環；72℃延伸5min。

1.2.3 化學物質檢測

參照李永忠等[15]方法進行煙葉常規化學物質檢測,每個樣品設置3個重復。有機碳采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化容量法；全氮采用H2SO4-H2O2消化-蒸餾法；全磷采用H2SO4-H2O2消化-鉬黃比色法；全鉀采用H2SO4-H2O2消化-火焰分光光度法；水溶性總糖采用80%酒精浸提-蒽酮比色法；煙堿采用堿蒸餾-紫外分光光度法；淀粉采用稀酸水解-蒽酮比色法；蛋白質采用凱氏定氮法；粗纖維采用酸堿洗滌-重量法；石油醚浸提物采用石油醚浸提-重量法。

1.2.4 數據處理

①序列處理及OTU注釋：根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據,截去Barcode和引物序列后使用FLASH[16]對每個樣品的Reads進行拼接,得到原始Tags數據；參照Qiime[17]的Tags質量控制流程,經過Tags截取、過濾及嵌合體去除等處理后得到高質量的有效Tags數據。利用Uparse軟件,以97%的一致性將序列聚類為OTUs(Operational Taxonomic Units),選取OTUs的代表性序列用Mothur方法與SSU rRNA數據庫對OTUs進行物種注釋,并在OTU水平上進行α多樣性分析。

②細菌群落動態變化分析：通過韋恩圖分析陳化不同時間的樣品OTUs分布差異；根據所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息,選取豐度排名前35的類群,從物種和樣品兩個層面進行聚類,繪制成熱圖,分析不同陳化時間樣品優勢細菌類群變化情況；通過LEfSe系統分析不同陳化時間的樣品間顯著差異的物種。

③細菌群落變化與化學成分關系分析：結合不同陳化時間優勢細菌及關鍵類群,利用SPSS 19.0、CANOCO 5等統計學軟件對細菌群落與各化學指標進行相關性分析和冗余分析(RDA)。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果

圖1 Shannon-Winner指數曲線Fig.1 The Shannon-Winner curves GY：貴陽庫；TC：壇廠庫；ZY：紫云庫；0、6、12、18、24：陳化時間,0個月、6個月、12個月、18個月、24個月

Shannon-Winner指數曲線可反映各樣本的物種多樣性隨測序量的變化情況[18]。如圖1所示,隨著樣品序列數的增加,Shannon-Winner指數曲線越趨向平坦,表明本試驗測序的數據深度能較全面地反應測序樣品中微生物信息。

樣品DNA高通量測序結果如表1所示,經拼接、優化、過濾后得到1191887條有效序列,每個樣品得67940—86235條；以97%的一致性將序列聚類,平均得到1099個OTU。對不同樣品的α多樣性指數進行對比分析發現,樣品細菌豐富度的Chao1指數和ACE指數分別在510.34—3528.94和520.33—2226.74之間。反映菌群多樣性的Shannon和Simpson值分別達到3.47—6.59和0.70—0.96。其中,樣品GY-0細菌最豐富,多樣性最大,Shannon指數達6.59,樣品ZY- 18多樣性最低,Shannon指數為3.47；樣品GY- 24和TC-0均勻性最好,Simpson指數均達到0.97,ZY- 18均勻性最差,Simpson指數為0.70。所有樣品Coverage指數均達到0.98以上,表明本次研究所測得的數據足夠反應煙葉細菌群落的多樣性。

表1 樣品測序結果及α多樣性指數信息

GY：貴陽庫；TC：壇廠庫；ZY：紫云庫；0、6、12、18、24：陳化時間,0個月、6個月、12個月、18個月、24個月

2.2 細菌群落組成

煙葉細菌種類豐富,分屬于493個屬,每個樣品相對豐度大于1.0%的類群組成,如圖2所示(< 1.0%的歸于Others)。假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、寡養單胞菌屬、芽孢桿菌屬為主要優勢類群,其中,假單胞菌屬占主導優勢,占17.8%—44.3%,其次是鞘氨醇單胞菌屬,占8.0%—23.6%。

圖2 屬水平上相對豐度柱狀圖Fig.2 Histogram of relative abundance at the genus level

2.3 不同陳化時間煙葉細菌群落動態演替分析

2.3.1 OTU變化分析

在OTU水平上繪制韋恩圖,如圖3所示。貴陽庫(圖3A)樣品有313個共有OTUs,陳化0、6、12、18、24個月時分別有267、110、90、120、159個特有OTUs。壇廠庫(圖3B)樣品有170個共有OTUs,陳化0、6、12、18、24個月時分別有249、82、126、115、262個特有OTUs。紫云庫(圖3C)樣品有176個共有OTUs,陳化0、6、12、18、24個月時分別有192、97、140、41、264個特有OTUs。共有的OTUs表明這些細菌類群的作用在煙葉陳化過程中貫穿于陳化的始終,是煙葉陳化的主要細菌類群；不同陳化階段特有OTUs表明煙葉陳化過程中功能細菌群落與陳化進程密切相關,演替現象明顯。

圖3 不同陳化時間樣品OTUs韋恩圖Fig.3 Analysis of OTUs from samples of different aging time via Venn diagram圖A：貴陽庫樣品OTUs；圖B：壇廠庫樣品OTUs；圖C：紫云庫樣品OTUs

2.3.2 優勢細菌類群變化分析

針對陳化不同時間對所有樣品進行組合分析,發現煙葉細菌群落結構隨陳化時間的延長發生了較大變化(圖4)。陳化開始時擬桿菌門的Sphingobacterium,變形菌門的Steroidobacter、Aquicella、Legionella、Pseudoxanthomonas、Methylobacterium及厚壁菌門的Romboutsia等類群占優勢。6個月時變形菌門的Pusillimonas和Vulgatibacter占優勢。12個月時綠彎菌門的unidentified_Anaerolineaceae占優勢。18個月時,所有類群的豐度都相對較低,變形菌門的Pusillimonas占優勢。24個月時,變形菌門的Stenotrophomonas和Comamonas,厚壁菌門的Solibacillus、Bacillus、Staphylococcus、Paenibacillus及放線菌門的Kocuria等類群優勢明顯。

整體來看,隨著煙葉陳化時間的增加,細菌優勢類群種類先減少后增加,其中變形菌類逐漸減少,厚壁菌類和放線菌類逐漸增加,這種變化與李曉強研究結果相似[19]。

圖4 不同陳化時間樣品物種豐度聚類熱圖Fig.4 Heatmap of species abundance for samples of different aging time

2.3.3 關鍵細菌類群變化分析

通過LEfSe分析(LDA 值默認為4)發現,在煙葉陳化0、12、24個月時樣品之間具有顯著差異的細菌類群,結果如圖5所示。陳化開始時Methylobacterium差異顯著,起重要作用。陳化12個月時 Enterobacteriaceae起重要作用。陳化24個月時Bacillus、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas差異明顯,發揮重要作用。LEfSe分析表明隨煙葉陳化時間延長,關鍵優勢菌群發生一系列演變,先是由Methylobacterium向Enterobacteriaceae演變,隨后向Bacillus、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas變化。其中,Methylobacterium、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas、Enterobacteriaceae均屬于變形菌門類群,Bacillus屬于厚壁菌門類群,因此,隨陳化時間延長,厚壁菌門優勢逐漸增加,芽孢桿菌優勢度后期明顯增強。

圖5 不同陳化時間物種LDA值分布柱狀圖Fig.5 The LDA score distribution histogram of LEfSe analysis in different aging time

2.4 細菌群落演替與煙葉化學成分的關系

RDA分析結果中,軸1和軸2累積變量分別為50.70%和73.24%,化學物質變化對細菌群落演替整體解釋量為78.90%。據圖6和表2可知,水溶性總糖對細菌群落動態影響最大,其次是纖維素。陳化開始時(Ⅰ),水溶性總糖貢獻最大,與Pusillimonas顯著負相關,相關系數為-0.546,與Steroidobacter、Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto_1、Legionella顯著正相關,相關系數分別為0.613、0.613、0.656、0.517。陳化12個月時(Ⅱ),淀粉、石油醚浸提物及總氮、總磷等影響最大,石油醚浸提物與Xanthomonas呈顯著負相關,相關系數為-0.541,與Pusillimonas、Vulgatibacter呈顯著正相關,相關系數為0.579、0.524；總磷與Xanthomonas呈顯著負相關,相關系數為-0.528。陳化24個月時(Ⅲ),纖維素作用最明顯,與Staphylococcus、Aureimonas、Massilia呈顯著正相關,相關系數為0.562、0.539、0.528。隨著時間的延長,細菌群落發生了由降解糖類向降解淀粉類菌群變化,再向降解纖維素類菌群變化的演替現象,這與化合物的逐級降解相關。

圖6 優勢細菌群落與化學物質RDA分析Fig.6 Redundancy analysis based on bacterial community and chemical substanceb1—b24：假單胞菌屬Pseudomonas、寡養單胞菌屬Stenotrophomonas、芽孢桿菌屬Bacillus、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、叢毛單胞菌屬Comamonas、甲基桿菌屬Methylobacterium、葡萄球菌屬Staphylococcus、Aureimonas、黃單胞菌屬Xanthomonas、馬賽菌屬Massilia、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、極小單胞菌屬Pusillimonas、Steroidobacter、unidentified_Anaerolineaceae、土壤芽孢桿菌屬Solibacillus、Romboutsia、鞘脂桿菌屬Sphingobacterium、庫克菌屬Kocuria、Clostridium_sensu_stricto_1、Vulgatibacter、軍團菌屬Legionella、Aquicella、假黃色單孢菌屬Pseudoxanthomonas、腸桿菌科Enterobacteriaceae

3 討論

煙葉陳化是在環境可控的人工倉儲設施內進行的自然發酵過程。在此過程中煙葉不僅為復雜的微生物體系提供了棲息地和營養物質,還為微生物活動提供多樣的生態位,以維持陳化生態系統的正常運行；反之,微生物在滿足自身生長繁殖的同時,分泌各種生物酶分解有機大分子物質,促進煙葉的陳化進程。本研究發現煙葉表面細菌物種豐富,以假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、寡養單胞菌屬、芽孢桿菌屬等為優勢類群,這與前人研究結果相似[20-21]。近年來發現許多假單胞菌菌株能高效降解煙葉尼古丁[22]；部分芽孢桿菌能分泌蛋白酶、淀粉酶等多種生物酶,促進煙葉大分子物質降解[6]；鞘氨醇單胞菌是降解芳香化合物的新型生物資源[23],對煙葉芳香類化合物的降解具有廣泛應用前景。因此,煙葉陳化是多種微生物協同作用的結果,微生物是陳化的主要驅動因子。

煙葉陳化是一個微型動態過程,早期研究表明隨陳化時間的延長,煙葉表面細菌數量、種類及多樣性后期明顯呈下降趨勢[24-25],但對于具體菌群的變化還不明確。本研究結果表明,隨陳化時間的增加,細菌群落消長演替,優勢細菌類群不斷變化,由變形菌門向厚壁菌門演變,芽孢桿菌后期作用顯著。目前對于煙葉陳化過程中微生物群落變化主要有兩種解釋：第一種觀點認為是陳化環境條件決定了煙葉上微生物的豐度和種類及其演化過程。Di Giacomo等研究人員認為,環境溫度和pH是促進微生物動態演替的主要動力之一[4]。浦紹占等在研究云南玉溪紅塔區和元江縣兩倉庫中不同自然陳化時期的紅大品種烤煙表面微生物種群結構時,發現不同時期、不同地點陳化煙葉表面細菌的優勢種群不盡相同[3]。Chopyk等比較了在室溫、冰箱、人的口袋三種不同儲存條件下五種不同品牌香煙制品細菌群落組成及動態變化,發現香煙品種對煙葉細菌群落影響不大,而儲存條件對煙葉微生物豐度及動態變化影響較大[26]。這主要是由于不同的儲存地或儲存方式中環境溫度、濕度、pH及其他生態因子的不同而導致煙葉表面微生物群落結構的差異。第二種觀點認為是由于化學成分的改變而引起煙葉微生物群落的改變。葉建斌等曾推測在原煙進入陳化階段后,由于培養成分的改變,適者生存,不適者淘汰,從而形成了新的微生物群落結構[27],但他們沒有對該推測進行驗證。本研究發現(表2)在煙葉陳化開始時,水溶性總糖的影響較大,與優勢菌群甲基桿菌類呈正相關關系；12個月時,淀粉、石油醚浸提物及總磷、總氮等的影響較大,與腸桿菌類呈正相關關系；24個月時,纖維素是影響的主要因素,與芽孢桿菌類、鞘氨醇單胞菌類、叢毛單胞菌類、假單胞菌類等優勢菌群呈正相關關系。本研究還發現細菌間的銜接與煙葉有機質的逐級降解相關聯(圖6),前期主要是以能降解糖類和淀粉的微生物為主,后期主要是以能降解纖維素和木質素的微生物為主。這充分證實了化學成分的改變是微生物群落演替變化的主要動力之一。

表2 細菌群落變化與煙葉化學成分相關性分析

*在0.05水平相關性顯著,**在0.05水平上相關性極顯著

在煙葉陳化生態系統中,陳化是在微生物的驅動下進行的,而煙葉的陳化伴隨著微生物的演替,微生物的演替受陳化環境和化學成分的共同驅動。通過對煙葉微生物群落組成、群落演替分析,可以確定最優的微生物群落組成,對微生物群落變化與化學成分關系分析,有助于煙葉陳化進程的人工調控。