毛竹林集約經營對土壤固碳細菌群落結構和多樣性的影響

劉彩霞,周 燕,徐秋芳,*,陳俊輝,秦 華,李永春,梁 雪

1 浙江省森林生態系統碳循環與固碳減排重點實驗室,浙江農林大學,臨安 311300 2 浙江農林大學環境與資源學院,臨安 311300

毛竹(Phyllostachypubescens) 又稱楠竹,多年生禾本科剛竹屬植物,主要分布在長江以南地區,是我國分布最廣、面積最大的經濟竹種。據第八次全國森林資源清查報告顯示,毛竹面積已達443.01萬hm2,占我國竹林總面積的73.7%[1]。二十世紀八九十年代我國南方地區開始大規模推行以施用化肥為主要特征的集約化經營,這一措施提高了當地農民的收入,但長期集約化經營也給生態環境帶來一系列負面影響。土壤中積累的大量養分元素通過地表徑流、滲濾和淋溶的方式進入地表和地下水,造成農業面源污染[2- 4]。更重要的是不同學者已研究發現施肥、翻耕等集約化經營措施導致了毛竹林土壤三大菌群細菌、真菌和放線菌[5-6]以及某些功能菌群如固氮菌[7]和氨氧化菌[8]群落結構的變化。

土壤微生物多樣性和群落結構顯著影響土壤生態系統過程和功能的發揮,特別是地球生物化學碳循環過程[9]。生物固碳是地球生物化學碳循環中的重要環節,自然界中固定CO2的生物主要有植物和自養微生物,其中自養微生物具有極強的環境適應能力,廣泛存在于草地[10]、森林[11]、水稻土[12],和海洋深處[13]不同的生態系統中。自養微生物主要通過同化CO2并將其轉化為土壤有機碳來調節大氣中CO2濃度和提高土壤的碳固定[14],對減緩大氣CO2濃度升高發揮著不可忽視的作用。自養微生物迄今為止發現的5條固碳途徑中,卡爾文循環是自養微生物同化大氣 CO2的主要調控途徑[15],1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)是該過程中的關鍵酶。自然界存在的不同類型RubisCO,按照其結構、催化性能和對O2的敏感性可分為4種,依次為RubisCOⅠ至RubisCO Ⅳ[16]。cbbL是RubisCOⅠ的編碼基因,且具有高度保守性,已被用于農田[14]、草地[10]、湖泊海洋[13],等不同生態環境中固碳微生物群落多樣性的研究。

不同學者分別對福建、湖南、江西以及四川等毛竹主產區的毛竹林生態系統碳貯量進行估算,證實了毛竹林生態系統極強的年固碳能力[17-19]。同時發現,毛竹林土壤中貯存的碳量明顯高于毛竹喬木層碳,周國模等[20]利用標準樣方法估算毛竹林生態系統碳貯量為106.33 t/hm2,其中0—60 cm土壤層碳貯量為71.47 t/hm2,喬木層為30.580 t/hm2,土壤層碳貯量約為喬木層碳貯量2.3倍。近年來關于毛竹林地上部分固碳作用及毛竹林生態系統貯碳量已被廣泛研究[21- 22],而土壤微生物在毛竹林生態系統中的固碳作用卻未見報道。本研究假設,集約經營可能對土壤固碳微生物活動產生影響。本研究選取不同集約經營歷史的毛竹林地土壤,揭示集約經營對毛竹林土壤固碳cbbL基因的豐度和群落結構多樣性的影響,以期為毛竹林的固碳潛力及可持續土壤管理提供數據支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于浙江省麗水市遂昌縣,介于118°41′—119°30′E,28°13′—18°49′N之間,坡度20—25°,向陽,屬亞熱帶季風氣候區,多年平均氣溫16.8℃,無霜期251 d,降水量1510 mm。母巖為由花崗巖變質的片麻巖石,壤土,土壤深厚、疏松,土層厚度大于1 m。1989年之前為竹林管理粗放經營,以劈山、墾復為主,不施用任何肥料,毛竹密度為1800株/hm2左右。1989年后陸續在不同地塊開始實施以施肥翻耕為主的集約經營管理,林下基本沒有灌木雜草,毛竹平均密度約3250株/hm2左右。施肥方法為:大量出筍的大年,在6月份留養的新竹葉子完全展開后,在每株毛竹的上方開出環形溝,施用尿素(或碳銨)450 kg/hm2;2000—2010年期間進行配方施肥,用量為尿素450 kg/hm2,過磷酸鈣380 kg/hm2,氯化鉀75 kg/hm2;2010年之后施用毛竹專用肥(福建中化生產)750 kg/hm2和尿素450 kg/hm2。

1.2 樣品采集與處理

于2013年9月,選擇由同一農戶經營、并位于同一山上,施肥管理措施一致,不同時間開始集約經營(主要是施肥和翻耕)以及位于同一山上相鄰未施肥的粗放經營毛竹林地,經營時間分別為:粗放經營(未施肥對照)、2003年、1998年、1993年和1988年,相當于集約時間分別為0 a(記為CK)、10 a、15 a、20 a、25 a,4個時間梯度(處理)。每個年份毛竹林分別選取3個20 m×20 m樣地(即為3個重復),每個樣地采用 5 點取樣法采集表層(0—20 cm)和亞表層(20—40 cm)土壤充分混勻過篩(2 mm)裝入采樣袋。樣品分為2份,1份放到-70 ℃冰箱,經冷凍干燥后,供分子生物學研究;另1份于室內自然風干后,研磨過篩用于基本理化性質分析。

1.3 土壤理化性質分析

1.4 土壤固碳微生物分析

1.4.1 土壤固碳功能菌cbbL基因熒光定量PCR

采用PowerSoilTMTotal DNA Isolation Kit試劑盒提取土壤總DNA,稱取0.5 g凍干土樣品,按照說明書進行DNA提取。經1%瓊脂糖凝膠電泳對所提取DNA的效果進行鑒定,并用微量分光光度計測定其濃度和純度。提取后的DNA分裝并保存于-40℃。

采用實時熒光定量PCR(Real-time Quantutative PCR,qPCR)測定固碳功能菌cbbL基因拷貝數,上游引物:K2f[11]5′-ACCA[C/T] CAAGCC[G/C] AAGCT[C/G] GG- 3′,下游引物V2r : 5′-GCCTTC[C/G] AGCTTGCC[C/G] ACC[G/A] C- 3′,得到492 bp—495 bp的擴增產物[24]。使用CFX 96TMReal-Time System(Bio-Rad, USA)儀器對cbbL基因進行熒光定量PCR擴增,每個樣品重復3次。體系組成如下: 2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL,50 μmol/L上游和下游引物各0.2 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 補水至 20 μL。反應程序參照文獻[24]:95℃預變性 3 min,40個循環包括95℃ 10s,62℃ 40 s,72℃ 30 s。熒光定量PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后,與pEASY-T3載體連接并轉接入大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞,在含Ampicillin平板上進行藍白斑篩選陽性克隆,挑選部分陽性克隆子送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序獲得的已知陽性克隆子擴大培養提取質粒DNA,用微量分光光度計檢測濃度和純度(OD260/OD280)。重組質粒梯度稀釋后8倍作為cbbL基因的熒光定量PCR標準樣品,標準樣品的反應體系和反應程序同上[24]。溶解曲線為單一峰型,說明條件符合要求,引物特異性良好。表層和亞表層土壤擴增效率為96.6%和93.9%,標線R2均大于0.995。

1.4.2 固碳功能菌cbbL基因末端限制性片段長度多態分析(T-RFLP)

采用T-RFLP技術分析固碳功能菌群落,引物K2f和V2r[10]。上游引物5′端用FAM熒光標記,反應體系包括Premix 10 μL、10 μmol /L的上游和下游引物各0.2 μL、Bovine Serum Albumin(BSA,20 mg/mL)0.2 μL、DNA模板0.3 μL、ddH2O 補水至50 μL,反應程序[26]:95℃ 預變性3 min,95℃變性1 min,62℃退火1 min,72℃延伸90 s,35個循環,72℃ 10 min。PCR產物經純化后,用限制性內切酶MspI在37℃下消化4 h,酶切產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司利用毛細管電泳檢測自動測序分析。將圖譜中±1 bp T-RFs視為一個OTU,當T-RFs的相對豐度>1%時可納入后續分析;相對豐度>10%被視為優勢種群[24]。

1.4.3 固碳功能菌cbbL基因克隆文庫

構建固碳功能細菌cbbL基因克隆文庫來確定固碳自養微生物的種類。擴增PCR,引物及反應程序同熒光定量PCR。PCR產物純化后連接到pEASY-T3載體連接并轉接入大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞,在氨芐青霉素平板進行藍白斑挑選,驗陽挑選200個陽性克隆子送至生工生物工程有限公司(上海)測序。利用DOTUR軟件將相似性大于97%的序列視為同一操作分類單元(Operational Taxonomic Unit, OTU)[25]。分別以NCBI數據庫中cbbL基因BLAST結果相似性大于90%的序列為參比序列[25],利用Clustal X進行多重比對,采用MEGA 5.0 中的Neighbor-joining 法構建系統發育樹。所獲得的cbbL基因序列提交至NCBI,序列登錄號為MF430937-MF431023。

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2007軟件對數據進行處理,OriginPro 8軟件作圖,SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。根據T-RFLP圖譜中OTU的數目及其豐度通過BIO-DAP程序(http://nhsbig.inhs.uiuc.edu/wes/population.html)計算樣品的多樣性指數。采用Canoco 4.5軟件(Mocrocomputer Power,Ithaca,USA)對T-RFLP結果進行冗余分析(RDA)。

2 結果分析

2.1 毛竹林集約經營過程中土壤理化性質變化

表1 不同集約經營年限毛竹林土壤理化性質

CK: 空白對照,Control check; 10 a: 集約經營10年;15 a: 集約經營10年;20 a: 集約經營20年;25 a: 集約經營25年;平均值±標準偏差(n=3);同列數值后不同小寫字母代表同一土層不同經營年限的顯著性差異(P<0. 05);除全氮和C∶N比數據外,其他指標與何冬華等[7]相同

2.2 毛竹林集約經營過程中土壤cbbL基因數量變化及其與土壤性質的關系

圖1 不同集約經營年限毛竹林土壤固碳細菌cbbL基因豐度 Fig.1 Abundance of cbbL gene under long-term intensive managed Phyllostachys pubescens stand大寫字母代表0—20 cm土層不同經營年限的顯著性差異(P<0.05);小寫字母代表20—40 cm土層不同經營年限的顯著性差異(P<0.05)

2.3 毛竹林集約經營過程中土壤固碳細菌結構及物種變化

圖2 不同集約經營年限毛竹林土壤固碳細菌cbbL基因T-RFs相對豐度Fig.2 Relative abundance of cbbL T-RFs under long-term intensive managed Phyllostachys pubescens forests T-RFs: 限制性多態片段,Terminal restriction fragments

擴增的產物經MspI酶切處理后,得到40—488 bp之間的T-RFs19條。如圖所示(圖2)其中177 bp是所有表層和亞表層土壤的優勢片段(20.70%—45.52%)。第二優勢片段40 bp(7.96%—17.79%),隨著集約經營時間延長其相對豐度提高,分別在表層和亞表層15 a達到最大值(17.79%和16.57%),在隨后的經營年限中又逐漸下降。213 bp與40 bp具有相同的變化規律,但并未成為優勢片段。360 bp與40 bp及213 bp規律相反,表層和亞表層15 a豐度最低(3.06%和11.77%),它是亞表層的第三優勢片段。以上描述的片段出現在所有土壤處理(年限)中,集約經營措施只改變其豐度;而有些片段只出現在某1個或幾個集約經營年限土壤中,如表層中的49 bp、127 bp、129 bp和亞表層中的362 bp在CK中出現,隨著集約經營的進行消失,在隨后的經營年限土壤中又出現;相反表層中的219 bp、364 bp和488 bp與亞表層42 bp、219 bp并未在CK中出現,在毛竹林開始集約經營后逐漸出現;488 bp是表層特有片段,但并非優勢片段。說明施肥翻耕對這些片段代表的微生物產生影響。

圖3 基于部分cbbL序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on partial cbbL sequences

本研究挑選200個陽性克隆子測序,基于97%的相似性被分成64個OTU。系統進化分析結果顯示(圖 3),序列共形成3個未知 Cluster 簇(56%),余下的序列與變形菌門(Proteobacteria)的α-Proteobacteria(11%)和γ-Proteobacteria(6%)以及Actinobacteria(28%)相似度較高。T-RFLP圖譜結合系統發育分析發現,第一優勢T-RF片段177 bp與慢生根瘤菌Bradyrhizobiumottawaense(LT629693.1) 、慢生根瘤菌Bradyrhizobiumicense(CP016428.1)、沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonaspalustris(CP000283.1)、Starkeyanovella(CP002026.1)、高溫單孢菌Thermomonosporacurvata(CP001738.1)和Dokdonellakoreensis(CP015249.1)親緣關系較近,分布在3個未知 Cluster 簇、α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria簇和Actinobacteria簇上,與來自草地[10]、森林[25]和水稻土[12]的基因序列相似度高。362 bp和36 bp與Thermomonospoacurvata(CP001738.1)親緣關系較近,分布在Actinobacteria簇上,與來自旱地[26]和草地[10]的基因序列相似度高。175 bp分布在Cluster Ⅲ簇上,同樣與來自旱地[26]和草地[10]的基因序列相似度高。第二優勢片段40 bp本研究中雖未克隆到該片段,但已有學者[27]利用與本研究相同的MspI酶研究固碳細菌時發現,(40±1) bp與Bradyrhizobiumottaweanse(LT629693.1)的親緣相似度達76%。

2.4 毛竹集約經營過程中cbbL基因多樣性變化

表2 不同經營歷史毛竹林土壤固碳微生物多樣性指數

同列數值后不同小寫字母代表不同經營年限的顯著性差異(P<0. 05)

表3 土壤理化因子與cbbL基因多樣性指數相關性分析

*代表相關性達到顯著水平P<0.05;**代表相關性達到極顯著水平P<0.01

2.5 環境因子對土壤固碳微生物群落結構的影響

以T-RFLP 片段信息和土壤化學性質為兩組變量進行冗余分析(RDA)(圖4)。從二維排序軸上可知,表層土壤中CK與集約經營10 a、15 a、20 a、25 a樣地在第一排序軸上顯著分開,CK主要分布在第一排序軸正軸上,10 a、15 a、20 a、25 a處理主要分布在第一排序軸負軸上。亞表層土壤中CK與10 a、15 a、20 a樣地固碳細菌群落結構較為接近,在第一排序軸上與25 a分開,CK與10 a、15 a、20 a主要分布在第一排序軸負軸上,25 a主要分布在第一排序軸正軸上。以上結果說明集約經營措施對表層和亞表層土壤固碳細菌的群落結構均有顯著影響。

圖4 毛竹林土壤固碳細菌群落結構的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of CO2 fixating bacterial community in soils of Phyllostachy spubescens stand

3 討論

以施肥和翻耕為主的集約經營顯著影響了毛竹林土壤三大菌群細菌、真菌和放線菌[5-6]以及某些功能菌群如固氮菌[7]和氨氧化菌[8]群落結構的變化。本研究假設,集約經營可能同樣對固碳微生物產生影響。T-RFLP 圖譜分析表明,毛竹集約經營后某些片段從無到有(表層中的219 bp和364 bp與亞表層42 bp、219 bp),某些片段從有到無、再出現(表層中的49 bp、127 bp、129 bp和亞表層中的175 bp、362 bp),說明毛竹林進行集約經營顯著影響固碳細菌群落結構。第一和第二優勢片段177 bp和40 bp的相對豐度增加,毛竹林集約經營后表層土壤177 bp在亞表層土壤變化不明顯、片段40 bp表現出增加趨勢。從系統發育可知,優勢片段多為兼性自養細菌,與Tolli等[11]報道的松林和旱地的兼性自養細菌大于專性自養細菌的結論相類似。袁紅朝等[28]在研究施肥對固碳功能菌群落結構時發現,長期施肥使硫桿菌,亞硝化螺菌(嚴格自養菌)等種群優勢明顯降低,而產堿桿菌(兼性自養菌)優勢度上升。固碳自養細菌按能量來源可分為光能型和化能型,Wu 等[29]的研究顯示光照主要影響表層1 cm左右的碳同化自養微生物。而兼性自養細菌則能夠利用除有機化合物外更廣的能量,如銨鹽、亞硝酸、硫、硫化氫等無化合物,在光源不足的土層中保證其正常的生長代謝,因此其成為優勢種群。

4 結論

本研究表明,長期集約經營顯著提高了毛竹林表層和亞表層土壤的養分含量、降低土壤pH 值。集約經營毛竹林土壤固碳微生物數量并未表現出與SOC的相關性,而與N素水平的變化顯著相關。具體表現為:隨著集約經營的進行表層土壤cbbL基因豐度呈先上升后下降的規律,與氮素水平呈正相關;亞表層土壤cbbL基因豐度則呈直線下降趨勢,與C∶N比呈正相關。集約經營導致表層和亞表層土壤微生物群落結構改變、表層固碳細菌多樣性指數下降。系統發育分析表明,不可培養固碳細菌占56%比例,土壤中具有共同的優勢種類多為變形菌和放線菌,以兼性自養為主。RDA分析結果表明土壤酸化和養分積累是毛竹林土壤固碳細菌群落和多樣性變化的重要原因。