漫話同位素示蹤法

張淑銘 林穎韜 俞如旺，*

(1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350117； 2福建教育學(xué)院 福州 350025)

同位素是指一類原子核內(nèi)具有相同質(zhì)子數(shù)，但中子數(shù)不同，在元素周期表中處于同一位置的核素。其中，某些核素會(huì)因其不穩(wěn)定的性質(zhì)自發(fā)衰變成新核素，同時(shí)放出一種或多種射線，如α、β-、β+、γ、X等，這種特性稱為放射性。具有放射性的核素稱為放射性核素或放射性同位素，不具放射性的核素稱為穩(wěn)定同位素。

同位素示蹤法則是一種以同位素作為示蹤物質(zhì)，對(duì)研究對(duì)象的特征和行為進(jìn)行示蹤觀察的信息獲取方法，分為兩類： 放射性同位素示蹤法和穩(wěn)定同位素示蹤法。

1 同位素示蹤法的基本原理

同位素示蹤法的基本原理： 利用同位素及其化合物與相對(duì)應(yīng)普通元素及其化合物具有相同化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)，但核物理性質(zhì)不同的特點(diǎn)，將同位素作為標(biāo)記物，制備成含有同位素的化合物，代替相應(yīng)非標(biāo)記化合物進(jìn)行標(biāo)記。由于放射性同位素能夠放出射線，因此可通過射線的感光作用進(jìn)行放射自顯影，或利用射線的電離作用、熒光現(xiàn)象進(jìn)行核探測(cè)器檢測(cè)。而穩(wěn)定同位素雖不具有放射性，但其在原子質(zhì)量上與普通的相應(yīng)同位素有差別，因此可以通過質(zhì)譜儀、氣相層析儀、核磁共振儀等質(zhì)量分析儀來測(cè)定。

2 放射性同位素示蹤法的實(shí)驗(yàn)過程

2.1 選擇示蹤劑 根據(jù)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目需要選擇合適的示蹤劑。一般與待標(biāo)記有機(jī)物中所含的元素、放射性同位素的半衰期、射線種類及輻射能量以及同位素的毒性等有關(guān)[1]： ①為了達(dá)到實(shí)驗(yàn)的理想效果，一般選用研究對(duì)象中的特征元素進(jìn)行示蹤；②根據(jù)實(shí)驗(yàn)周期，選用半衰期合適的放射性同位素，一般能保證檢測(cè)結(jié)束時(shí)，放射性同位素的含量為給入量的70%為宜；③用的核素宜為純?chǔ)痢ⅵ?、γ射線的發(fā)射體，保證射線能量在1.0～2.5MeV的適宜范圍內(nèi)；④所選示蹤劑盡量避免高毒性。如實(shí)驗(yàn)必需，則應(yīng)控制其用量在對(duì)人體和環(huán)境無害的范圍之內(nèi)。綜上，將中學(xué)生物學(xué)探究活動(dòng)中常用的幾種放射性同位素的特征[2]整理成表1。

2.2 確定標(biāo)記方法 根據(jù)示蹤劑的性質(zhì)、形態(tài)以及研究目的和對(duì)象的不同，示蹤劑的標(biāo)記方式也有所不同。

表1 中學(xué)生物學(xué)探究活動(dòng)中涉及的放射性同位素的特征

對(duì)植物體的標(biāo)記方法有： ①“植物營(yíng)養(yǎng)室”培養(yǎng)法。在密閉的植物營(yíng)養(yǎng)室中，通入放射性氣體供植物進(jìn)行光合作用。②植物地上部引入法。將示蹤劑配制成濃度合適的溶液，通過涂抹、噴霧、注射等方法將示蹤劑從植物的地上部引入植物體內(nèi)。③植物根部引入法。即將示蹤劑加入栽培介質(zhì)如水、沙、土等，供給植物生長(zhǎng)。

對(duì)于動(dòng)物體的標(biāo)記方法有： ①注射法。即利用針管等，將示蹤劑直接注射入機(jī)體內(nèi)。②口服法。通過進(jìn)食、飲水、胃管或投丸等途徑引入。③涂布滲入法。清除動(dòng)物部分皮毛，將示蹤劑涂抹于脫毛處。④吸入法。將揮發(fā)性示蹤劑裝入密閉系統(tǒng)，通過呼吸作用吸入動(dòng)物體內(nèi)。

對(duì)于微生物的標(biāo)記方法通常用含放射性物質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)標(biāo)記。

上述三大類標(biāo)記方法在中學(xué)生物學(xué)教材中均有涉及。例如，探究光合作用有機(jī)物生成路徑的實(shí)驗(yàn)中，卡爾文即是利用“植物營(yíng)養(yǎng)室”培養(yǎng)法，在密閉的小室中，向小球藻供以14CO2進(jìn)行光合作用；探究分泌蛋白合成與運(yùn)輸路徑的實(shí)驗(yàn)中，詹姆森等通過注射法，向豚鼠的胰腺腺泡細(xì)胞注射3H標(biāo)記的亮氨酸；探究生物體遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，赫爾希與蔡斯則是利用含32P與35S的大腸桿菌作為活體培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)對(duì)噬菌體DNA及蛋白質(zhì)外殼的標(biāo)記。

2.3 制備放射性生物樣品 不同形態(tài)的樣品，其制備方法也有所不同。植物體常用打孔法或勻漿法，如探究光合作用有機(jī)物生成路徑實(shí)驗(yàn)即是通過研磨小球藻，制備勻漿樣品。動(dòng)物體組織既可采用勻漿法，也可進(jìn)行細(xì)胞組織切片的制作，如探究分泌蛋白合成與運(yùn)輸路徑的實(shí)驗(yàn)中，采取的方法即制備豚鼠胰腺腺泡細(xì)胞的超薄切片。對(duì)于沉淀等干物質(zhì)的樣品制備，則需先將其置于70～80℃的烘箱中烘干，并用研缽研磨制取粉末，再放入烘箱烘干，之后取出干燥制成薄膜狀樣品。液體樣品一般可直接進(jìn)行測(cè)量，或利用熱風(fēng)吹、電熱板或紅外燈進(jìn)行干燥鋪樣。如在噬菌體侵染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)沉淀物采取薄膜樣品制備，而上清液則利用儀器烘干進(jìn)行鋪樣檢測(cè)。

2.4 測(cè)量樣品放射性 放射性的檢測(cè)主要通過核探測(cè)器測(cè)量以及放射自顯影技術(shù)。

2.4.1 核探測(cè)器選擇依據(jù)及檢測(cè)原理 測(cè)量放射性的核探測(cè)器主要有氣體電離探測(cè)器、閃爍計(jì)數(shù)器以及半導(dǎo)體探測(cè)器3種。其中氣體電離探測(cè)器包括電離室、正比計(jì)數(shù)管以及蓋革-彌勒計(jì)數(shù)器3類。閃爍計(jì)數(shù)器根據(jù)閃爍體的形態(tài)不同分為固體和液體閃爍計(jì)數(shù)器兩類。

在示蹤實(shí)驗(yàn)中，核探測(cè)器的選擇與同位素放射的射線性質(zhì)有關(guān)。放射α射線的同位素，采用電離室進(jìn)行檢測(cè)；放射低能β射線的同位素，采用正比計(jì)數(shù)管或蓋革-彌勒計(jì)數(shù)器檢測(cè)；放射中能β射線以及高能β射線的同位素，采用β計(jì)數(shù)管或正比計(jì)數(shù)管檢測(cè)；放射γ射線的同位素，則采用γ計(jì)數(shù)管或晶體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)。中學(xué)教材中涉及到的放射性同位素，其射線性質(zhì)均為β射線，其中3H、14C、35S放射的是低能β射線，32P放射的是中能β射線，因此檢測(cè)儀器一般選用正比計(jì)數(shù)管或蓋革-彌勒計(jì)數(shù)器。

結(jié)合教材中噬菌體侵染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)，對(duì)蓋革-彌勒計(jì)數(shù)器的結(jié)構(gòu)及工作原理進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。蓋革-彌勒計(jì)數(shù)器由高壓電源、蓋革-彌勒計(jì)數(shù)管(G-M管)以及定標(biāo)器組成。其中，高壓電源為計(jì)數(shù)管提供電壓；定標(biāo)器記錄由計(jì)數(shù)管輸出的脈沖；G-M管根據(jù)其外形可分為鐘罩型和圓柱型，內(nèi)部充有惰性氣體。

在噬菌體侵染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)中，使用的為鐘罩型計(jì)數(shù)管(圖1)。在實(shí)驗(yàn)中，分別將分離后的上清液以及沉淀物置于計(jì)數(shù)管內(nèi)，由于32P以及35S衰變放射出β射線，使管內(nèi)原有的氣體被電離形成離子對(duì)。負(fù)離子被陽極吸引移向陽極，在此過程中，負(fù)離子會(huì)與管內(nèi)氣體發(fā)生碰撞，產(chǎn)生次級(jí)電子，在快到達(dá)陽極時(shí)，次級(jí)電子急劇倍增，產(chǎn)生“雪崩”現(xiàn)象，形成脈沖數(shù)，后經(jīng)放大由定標(biāo)器記錄。而正離子則被陰極吸引，當(dāng)移到陰極時(shí)，會(huì)再次產(chǎn)生電子，從而形成下一個(gè)脈沖數(shù)。由于管內(nèi)惰性氣體會(huì)與正離子發(fā)生電荷中和，因此防止了持續(xù)放電的情況。在測(cè)量過程中，通過改變電壓，分別記錄不同電壓下的脈沖數(shù)，制作計(jì)數(shù)管的特性曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出放射性強(qiáng)度。該實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果，在被35S標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)組上清液中，檢測(cè)到較高的放射性。而在被32P標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)組沉淀物中，檢測(cè)到較高的放射性，從而確定了DNA為遺傳物質(zhì)[3]。

圖1 鐘罩型計(jì)數(shù)管

2.4.2 放射自顯影技術(shù)原理 中學(xué)生物學(xué)教材中分泌蛋白合成與運(yùn)輸?shù)膶?shí)驗(yàn)，即是利用該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行放射性檢測(cè)?？茖W(xué)家分別在不同時(shí)間處死豚鼠，并制備其胰腺腺泡細(xì)胞的超薄切片。之后，將鹵化銀乳膠膜均勻敷于切片表面，置于暗室中曝光。由于3H衰變放射出β射線，與鹵化銀晶體顆粒反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榻饘巽y顆粒形成潛影，再經(jīng)顯影、定影后，即可用顯微鏡進(jìn)行觀察。該實(shí)驗(yàn)最終使用最佳的三次顯影效果確定了分泌蛋白合成與運(yùn)輸?shù)穆窂健?/p>

3 穩(wěn)定同位素示蹤法的實(shí)驗(yàn)過程

穩(wěn)定同位素示蹤法的實(shí)驗(yàn)過程與放射性同位素示蹤法相比較為簡(jiǎn)便，其示蹤劑的選擇以及給入過程與之相同，在此不作贅述。以下簡(jiǎn)要介紹穩(wěn)定同位素示蹤過程中樣品的制備以及測(cè)量的方法。

3.1 制備生物樣品 常見的樣品制備方法有： ①含N同位素樣品的制備，利用凱氏法或杜氏法將含氮有機(jī)生物樣品轉(zhuǎn)化為分子態(tài)的氮(N2)；②含C同位素樣品的制備，通過燃燒法將碳轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的CO2；③含O同位素樣品的制備，利用不含氧的催化劑在高溫條件下使有機(jī)物轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的CO2。

盡管同位素示蹤法應(yīng)用廣泛，但仍存在局限性，并不能解決所有的問題，往往需配合其他技術(shù)才能發(fā)揮作用。在中學(xué)教材中，探究DNA復(fù)制方式的實(shí)驗(yàn)，即是將穩(wěn)定同位素示蹤法與平衡密度梯度離心技術(shù)相結(jié)合。將含有14N和15N標(biāo)記的大腸桿菌培養(yǎng)液，在濃縮的CsCl溶液中進(jìn)行高速密度梯度離心。在離心的過程中，DNA由于受到離心力場(chǎng)的作用，聚集到溶液密度等于其自身浮力密度的區(qū)域。因子代DNA含有不同N標(biāo)記的亞基，其密度也就不同，致使結(jié)果出現(xiàn)不同位置的條帶，進(jìn)而可通過紫外照相及紫外掃描確定條帶位置。最終結(jié)果表明，DNA的復(fù)制方式為半保留復(fù)制，即每個(gè)子代只得到親代的一個(gè)亞基且世代穩(wěn)定遺傳[5]。