YC-1對肝部分切除術后老年小鼠認知功能及海馬神經元凋亡的影響

葛葉盈，王秀珍，袁娜，袁力勇，陳潔

（寧波市第六醫院 麻醉科，浙江 寧波 315040）

術后認知功能障礙（post-operative cognitive dysfunction，POCD）是嚴重的術后中樞神經系統并發癥。POCD的發病機制至今尚不清楚，腦血管栓塞、痙攣、腦組織的異常灌注等導致的低氧被認為是POCD的主要原因[1]。低氧誘導因子（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）作為一種轉錄因子，在缺氧條件下，可以啟動多種下游基因的轉錄激活，包括能激活下游促凋亡基因p53和BNIP3的表達，加強神經細胞的凋亡，導致神經細胞變性壞死，從而引起認知功能障礙[2]，但迄今為止未見HIF-1α參與POCD損傷機制的報道。目前認為老齡是唯一被明確的POCD危險因素[3]，手術創傷可能是主要的原因，本課題組前期研究發現肝切除術后老齡小鼠可出現短期認知功能障礙[4]，但具體機制尚不清楚。本研究觀察肝部分切除術對老年小鼠認知功能和海馬HIF-1α及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響，同時觀察使用特異性HIF-1α抑制劑3-（5′羥甲基-2′呋喃基）-1苯甲基引唑（YC-1）對上述各指標的影響，以探討HIF-1α蛋白及其下游基因作為POCD治療新靶點的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組：選用C57BL/6雄性小鼠，清潔級，鼠齡18個月，體質量25～35 g，由寧波大學動物研究所提供，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2013-0191，置25 ℃環境中飼養。利用Morris水迷宮測試剔除實驗第5天在2 min內仍找不到平臺的小鼠，最后篩選出48只并按隨機數字表法分成3組：假手術組（Sham組，n=16）、手術+0.9%氯化鈉溶液組（手術+NS組，n=16）和HIF-1α抑制劑YC-1組（手術+YC-1組，n=16），各組小鼠根據手術后測試時間的不同分為術后1 d、3 d兩個亞組，各亞組8只。

1.1.2 主要試劑和儀器：鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購自美國Novus公司，凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗體購自美國CST公司，YC-1購自英國Cayman公司，辣根過氧化氫酶標記羊抗鼠或羊抗兔的二抗購自美國Pierce Chemical公司，Morris水迷宮系統購自上海吉量科技公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備：將小鼠以10%（體積百分比）水合氯醛按0.04 mL/10 g腹腔注射麻醉，當翻正反射消失后將其仰臥位固定并消毒，于劍突下腹部正中線切開1.5～2.0 cm切口，分離左側葉肝臟，在遠端蒂部以1號絲線結扎后切除肝左葉，徹底止血后逐層關腹。Sham組腹腔注射水合氯醛麻醉，在肝部分切除術相同手術部位做切開縫合術。YC-1組在肝部分切除術前30 min、手術結束時以及術后1～3 d每天給小鼠腹腔注射1 mg/kg的YC-1（溶于0.9%氯化鈉溶液），具體參照文獻[5]；手術+NS組參照手術+YC-1組的相同時間注射相同劑量的0.9%氯化鈉溶液，給藥后1 h，開始進行Morris水迷宮測試。

1.2.2 Morris水迷宮實驗：參照文獻[6]的方法，進行Morris水迷宮實驗評價認知功能。Morris水迷宮由一直徑120 cm，高50 cm的白色圓形水池和一個可移動位置的平臺以及一套攝像、記錄系統組成。計算機可以自動跟蹤并記錄下小鼠的游泳軌跡。當設定的訓練時間已到或者小鼠已經爬上平臺，計算機停止跟蹤。軟件自動算出小鼠在水池中找到平臺所需要的時間（即逃避潛伏期）和跨越平臺的次數。以定位航行訓練和空間搜索測試小鼠的學習記憶能力。定位巡航實驗：術前訓練歷時4 d，每日訓練1輪，每輪每只小鼠訓練4次，如小鼠在120 s內未到達平臺，可引導小鼠上平臺，并讓小鼠在同一個入水點臺上停留10 s，每次訓練之間適當休息。實驗的第5天，剔除2 min內不能到達平臺的小鼠，休息1 d后手術。在手術后1 d、3 d，每天2次從離平臺最遠的象限，在固定的同一個入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在90 s內找到并爬上平臺的平均時間即逃避潛伏期，若在規定的時間內未找到平臺，按90 s計算。空間探索實驗：用于測量動物對于平臺空間位置的準確記憶，即記憶的保持能力。定位巡航實驗結束后撤除平臺，任選一點將動物放入水中，觀察90 s內小鼠在目標象限（原平臺所在象限）中跨越平臺的次數。

1.2.3 Western blot檢測：小鼠行為學測試完畢后次日麻醉后斷頭取腦，冰上分離海馬組織，取液氮凍存。采用Western blot法檢測Bcl-2、Bax、活化型Caspase-3表達。實驗開始后，將凍存的海馬組織取出，加入蛋白裂解液，勻漿后低溫高速離心，取上清液使用BCA法進行蛋白測定，-80 ℃低溫冰箱保存。取40 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，電泳分離的蛋白轉至硝酸纖維素膜，加入一抗，用含5%脫脂奶粉的1×TBST稀釋兔抗鼠Bcl-2抗體（稀釋度1:1 000）、Bax抗體（稀釋度1:1 000）、活化型Caspase-3抗體（稀釋度1:800），4 ℃孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（稀釋度1:3 000），室溫孵育30 min，再次洗膜后置于BCIP/NBT顯色液顯色，掃描蛋白印記圖，Alpha軟件系統（美國Alpha Gel Imaging公司）進行分析，β-Actin為內參，以目的蛋白條帶灰度值與內參β-Actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達水平。左側海馬檢測HIF-1α的表達水平，右側海馬檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS18.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，組內比較采用重復測量數據的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮測試 與Sham組相比，手術+NS組術后1 d、3 d平均逃避潛伏期明顯延長，空間探索跨越平臺次數減少（P＜0.01）；與手術+NS組比，手術+YC-1組逃避潛伏期縮短，空間探索跨越平臺次數增加（P＜0.05）。與術前比較，手術+NS組術后1 d、3 d平均逃避潛伏期明顯延長，空間探索跨越平臺次數減少（P＜0.01），而Sham組和手術+YC-1組差異無統計學意義（P＞0.05）。Sham組組內各時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1和圖1。

表1 各組小鼠Morris水迷宮找到平臺的潛伏期和跨越平臺數比較（每組8只，±s）

表1 各組小鼠Morris水迷宮找到平臺的潛伏期和跨越平臺數比較（每組8只，±s）

與Sham組比：aP＜0.01；與手術+NS組比：bP＜0.05；與術前比：cP＜0.01

跨越平臺次數手術前 術后1 d 術后3 d 手術前 術后1 d 術后3 d Sham組 26.58±5.28 28.39±4.59 30.22± 5.73 6.79±1.73 6.96±1.27 7.07±1.42手術+NS組 26.70±4.63 41.48±8.27ac 56.70±15.94ac 6.86±1.18 4.24±1.08ac 3.49±1.05ac手術+YC-1組 27.08±4.29 35.21±8.72b 37.93±10.47b 6.49±1.46 5.26±1.25b 5.28±1.28b逃避潛伏期（s）組別

圖1 術后1 d各組小鼠找到平臺的游泳軌跡圖

2.2 海馬HIF-1α及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達量的比較 術后1 d和3 d，與Sham組相比，手術+NS組海馬HIF-1α、Bax、Caspase-3蛋白表達量增加，Bcl-2蛋白表達量減少（P＜0.01）；與手術+NS組比，手術+YC-1組海馬HIF-1α、Bax、Caspase-3蛋白表達量減少，Bcl-2蛋白表達量增加（P＜0.05）。Sham組和手術+YC-1組比較，4種蛋白表達量的差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖2-5。

3 討論

圖2 3組小鼠海馬HIF-1α蛋白相對表達量的比較

圖3 3組小鼠海馬Bcl-2蛋白相對表達量的比較

圖4 3組小鼠海馬Bax蛋白相對表達量的比較

POCD正成為外科領域關注的問題，國內外大量研究認為POCD是在老年患者中樞神經系統退化的基礎上，由手術和麻醉誘發，多種因素聯合作用所致的神經功能減退，涉及到中樞神經系統、內分泌和免疫系統的紊亂[7-8]，所以本研究采用老年小鼠作為實驗對象。近年來POCD與低氧的關系漸漸引起學者的廣泛關注，國內外研究報道POCD的發生與腦氧飽和度（regional cerebral oxygen saturation，rSO2）下降有關，認為rSO2監測有可能是POCD的有效預測工具之一[9-10]。

圖5 3組小鼠海馬Caspase-3蛋白相對表達量的比較

HIF-1是一種特異性地結合于低氧反應元件的蛋白，由α和β這2個亞單位組成。HIF-1β能夠穩定性地表達，不受氧含量的調節，但HIF-1α是低氧誘導產生的轉錄激活因子，在細胞凋亡造成神經系統損害發生中起關鍵作用[11-12]。本課題組前期研究表明，肝部分切除術后1 d和3 d小鼠的認知功能受到抑制[4]。本研究選擇肝部分切除術作為POCD模型，術后1 d、3 d作為觀察點，由于海馬與認知功能有關[13]，因此選擇海馬作為研究對象。細胞凋亡過程中，Caspase家族和Bcl-2家族起關鍵作用，Bcl-2是凋亡抑制因子，Bax是凋亡促進因子，而Caspase-3是凋亡的最終執行者[14-15]。大量研究表明，認知功能障礙與神經細胞凋亡的關系密切[16-17]。本研究結果顯示，與Sham組比較，手術+NS組術后海馬HIF-1α及凋亡因子Bax、Caspase-3表達增加，而凋亡抑制因子Bcl-2減少，與行為學顯示的手術+NS組平均逃避潛伏期明顯延長，空間探索跨越平臺次數減少一致，提示HIF-1α參與了POCD的小鼠海馬神經元凋亡過程。

YC-1是HIF-1α的特異性抑制劑，在轉錄后水平抑制HIF-1α的表達[18-19]。本研究通過應用YC-1抑制HIF-1α表達后檢測肝部分切除術后HIF-1α及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達水平，進一步探討HIF-1α在肝部分切除術后的神經細胞凋亡中的作用。結果顯示抑制HIF-1α蛋白表達的手術+YC-1組細胞凋亡均顯著低于未經YC-1處理的手術組，由此進一步證明HIF-1α高表達在肝部分切除術后的細胞凋亡過程中發揮著損傷作用，其機制涉及抑制Caspase-3凋亡信號通路介導的細胞凋亡過程。同時行為學測試也表明應用YC-1抑制HIF-1α表達后與手術+NS組比較，平均逃避潛伏期明顯縮短，空間探索跨越平臺次數增多，再一次提示HIF-1α通過誘導神經元凋亡通路參與了POCD的發病機制。

綜上所述，老年小鼠肝部分切除術后可出現短期的認知功能障礙，HIF-1α致小鼠腦組織神經細胞凋亡可能是其發病機制之一，YC-1可以通過抑制海馬神經元的凋亡來改善肝部分切除術后小鼠的認知功能。